We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Nylig isolerte tumor-spesifikke endotelceller (TEC) kan brukes til å utforske molekylære mekanismer av tumor angiogenese, og tjener som en in vitro modell for å utvikle nye angiogeneseinhibitorer for kreft. Imidlertid er langvarig in vitro ekspansjon av murine endotelceller (EC) utfordrende på grunn av fenotypisk drift i kultur (endotelial-til-mesenchymale overgang) og forurensning med ikke-EC. Dette gjelder spesielt for TEC som lett utkonkurrert av ko-renset fibroblaster eller tumorceller i kultur. Her er en high fidelity isolasjon metode som utnytter immunomagnetisk berikelse kombinert med kolonien utvalg og in vitro ekspansjon beskrevet. Denne fremgangsmåten genererer rene EC fraksjoner som er helt fri for kontaminerende stromale eller tumorceller. Det er også vist at avstamning-spores Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter mus, brukt med protokollen beskrevet her, er et verdifullt verktøy for å verifisere mobilrenhet som de isolerte EC kolonier fra disse musene viser holdbar og strålende ZsGreen fluorescens i kultur.
Endotelceller (EC) er viktig i utviklingen av faste tumorer. Fra initiering av den angiogene bryter i sovende tumor til formidling og såing av metastaser i fjerne områder, EC danne ledningene som gir blod, oksygen og næringsstoffer for å opprettholde en tumorvekst. Som nylig foreslått, EC har også perfusjon-uavhengige funksjoner, og danner en nisje som støtter veksten av kreft stamceller og andre tumor stromale celler 2-5. Dermed høyt renset tumor-spesifikke EC (TEC) for in vitro kultur åpner for rutine funksjonelle studier som vil kaste lys over nye molekylære mekanismer som medierer tumorangiogenese og krysstale med tumorceller.
EC er svært spesialiserte avhengig av vevet opprinnelses 6. På grunn av den heterogene karakter av forskjellige tumortyper og svulsten mikromiljøet, kan også vise TEC unike egenskaper som gjenspeiler en tumorspesifikke fordypninger of blodkar. For eksempel er det påfallende variasjon i genekspresjonssignaturer i TEC isolert fra ulike typer eller grader av svulster 7,8. Imidlertid kan hyppig co-rensning av ikke-EC, spesielt tumorassosierte fibroblaster og tumorceller, med TEC forvirre genom-wide ekspresjon analyser. Disse uønskede celletyper er spesielt problematisk i studier som er avhengige av langsiktige in vitro utvidelse av TEC kulturer.
Beskrevet her er en high-fidelity metode som konsekvent produserer rene EF kulturer fra svulster og andre vev. Etter immunomagnetisk kolonne berikelse av EF-fraksjoner og fjerning av co-renset non-EC, til en ekstra kloning-ring trinn fange rene EF kolonier brukes 9. Hver koloni kan ekspanderes i kultur for flere passasjer uten at det oppstår forurensende ikke-EC. Denne metode gir også flere EC kloner fra en enkelt isoleringsprosedyren, som er ideelt for studiet av endothelial heterogenitet. I tillegg er det vist at Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter mus er et verdifullt verktøy for å generere "skjebne-kartlagt" og uutslettelig merket EC som opprettholder ZsGreen fluorescens i kultur 10. Med mindre justeringer i protokollen, skal denne metoden kunne tilpasses forskjellige typer svulst eller normalt vev.
På grunn av vanskelighetene med å oppnå rene primære TEC kulturer, mange in vitro-studier erstatning TEC med kommersielt tilgjengelige EC linjer eller primære EC så som humant navlevene EC (HUVEC) 13. Men disse EC populasjoner fra normalt vev bare tjene som en proxy for TEC som skiller seg markant fra sine vanlige kolleger. For eksempel, TEC er fenotypisk og funksjonelt unormal in vivo, og noen av disse avvikene kan være overførbare in vitro 14-18. TEC har avviken…
The authors have nothing to disclose.
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
Sterile water | – | – | |
Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
6-well tissue culture plates | Corning | – | |
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
Fine-tip marker | – | – | |
Hemocytometer | – | – | |
LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
Tissue culture hood | – | – | |
Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
Liquid nitrogen freezer | – | – | |
Microplate or rotary shaker | – | – | |
Phase contrast light microscope | – | – |