Isolering och odling Expansion av Tumörspecifika endotelceller
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
Nyligen isolerade tumörspecifika endotelceller (TEC) kan användas för att utforska molekylära mekanismer för tumörangiogenes och tjäna som en modell in vitro för att utveckla nya angiogeneshämmare för cancer. Det är dock en utmaning på lång sikt in vitro expansion av murina endotelceller (EG) på grund av fenotypisk drift i kultur (endotel till mesenkymala övergång) och förorening med icke-EG. Detta gäller särskilt för TEC som lätt konkurreras ut av samrenat fibroblaster eller tumörceller i odling. Här är en high fidelity isoleringsmetod som drar nytta av immunomagnetisk anrikning tillsammans med koloni val och in vitro expansionen beskrivs. Detta tillvägagångssätt genererar rena EG fraktioner som är helt fria från kontaminerande stromala eller tumörceller. Det är också visat att härstamning-spåras Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter möss, som används med det protokoll som beskrivs häri, är ett värdefullt verktyg för att kontrollera cellrenhet som isolerade EG kolonier från dessa möss visar hållbara och lysande ZsGreen fluorescens i kultur.
Introduction
Endotelceller (EC) är väsentliga vid utvecklingen av solida tumörer. Från initiering av den angiogena brytaren i vilande tumörer spridning och sådd av metastaser i avlägsna platser, EG bilda ledningarna som ger blod, syre och näringsämnen för att upprätthålla tumörtillväxt 1. Som nyligen föreslagit, EG har också perfusion oberoende funktioner och bildar en nisch som stödjer tillväxten av cancer stamceller och andra tumör stromaceller 2-5. Således, högrenat tumörspecifika EG (TEC) för in vitro-kultur möjliggör rutin funktionella studier som kommer att belysa nya molekylära mekanismer som förmedlar tumör angiogenes och överhörning med tumörceller.
EG högt specialiserad beroende på vävnaden ursprungs 6. På grund av den heterogena karaktären hos olika tumörtyper och tumörmikro kan TEC också visa unika egenskaper som återspeglar en tumörspecifik specialisering of vaskulaturen. Till exempel finns det påfallande variation i genuttryck signaturer i TEC isolerade från olika typer eller kvaliteter av tumörer 7,8. Däremot kan ofta co-rening av icke-EG, särskilt tumörassocierade fibroblaster och tumörceller, med TEC förväxla genomet hela uttrycket analyser. Dessa oönskade celltyper är särskilt problematiska i studier som är beroende av långsiktiga in vitro expansion av TEC kulturer.
Beskrivs här är en high-fidelity metod som konsekvent producerar rena EG kulturer från tumörer och andra vävnader. Efter immunmagnetisk anrikning i kolonnen av EG fraktioner och avlägsnande av samrenat icke-EG en ytterligare kloning-ringen steg fånga rena EG kolonier används 9. Varje koloni kan expanderas i odling för flera passager utan uppkomsten av förorenande icke-EG. Denna metod ger också flera EG-kloner från en enda isoleringsförfarandet, som är idealisk för att studera endothelial heterogenitet. Dessutom visas att Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter möss är ett värdefullt verktyg för att skapa "öde-mappade" och outplånligt märkta EG som upprätthåller ZsGreen fluorescens i kultur 10. Med smärre justeringar av protokollet, bör denna metod kunna anpassas till olika tumörtyper eller normala vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av svårigheter att få rena primär TEC kulturer, många i vitro-studier substitut TEC med kommersiellt tillgängliga EG-linjer eller primära EG såsom humant navelven EG (HUVEC) 13. Dock kan dessa EG populationer från normala vävnader bara fungera som en proxy för TEC som skiljer sig markant från deras normala motsvarigheter. Exempelvis TEC är fenotypiskt och funktionellt onormalt in vivo och en del av dessa avvikelser kan vara överförbart in vitro …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
References
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429 (2012).
- Dudley, A. C. Tumor endothelial cells. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).
- Aird, W. C. Molecular heterogeneity of tumor endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -. T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
