In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
Plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs) zijn krachtige type I interferon (IFN-I) producerende cellen die geactiveerd worden in reactie op infectie of tijdens ontstekingsreacties. Helaas is studie van PDC-functie gehinderd door hun lage frequentie in lymfoïde organen, en de bestaande methodes voor in vitro DC generatie overwegend voorstander van de productie van CDCS dan pDCs. Hier presenteren we een unieke benadering om efficiënt genereren pDCs van zachte lymfoïde voorlopers (CLPs) in vitro. Specifiek, het protocol beschreven hoe zuiveren CLPs uit beenmerg en pDCs genereren door coculturing met γ bestraalde AC-6 voedingscellen in de aanwezigheid van Flt3 ligand. Een uniek kenmerk van dit kweeksysteem dat de CLPs migreren onder de AC-6 cellen en wordt geplaveide-gebied vormende cellen, een kritische stap voor de uitbreiding pDCs. Morfologisch onderscheiden DCs, namelijk pDCs en CDCs werden gegenereerd na ongeveer 2 weken met een samenstelling van 70-90% pDCs onder optimale omstandigheden. Kenmerkend het aantal pDCs gegenereerd door deze methode is ongeveer 100-voudig van het aantal geënte CLPs. Dit is dus een nieuw systeem waarmee robuust genereren grote aantallen pDCs vereist verder onderzoek naar de ontwikkeling en functie van deze cellen vergemakkelijkt.
Introduction
Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigeenpresenterende cellen die een belangrijke rol spelen bij het regelen immuunreacties 1. Hoewel DCs zijn heterogeen, kunnen zij in grote lijnen worden ingedeeld in twee populaties, conventionele DC (CDC) en plasmacytoïde DCs (pDCs) 2,3. Naast lymfoïde organen, zijn CDCs en pDCs ook gevonden in weefsels waaronder longen, darmen en huid 2. De morfologie van CDCs en pDCs verschilt met CDCs vertonen dendriet uitsteeksels en de vorm van pDCs die meer plasma celachtige. Verder wordt een gemeenschappelijke muis DC marker, CD 11 c, sterker uitgedrukt op CDCs dan op pDCs. Bovendien kan CDCs verder worden onderverdeeld in CD11b + CD24 – CDCs en CD11b – CD24 + CDCs, die beide tot expressie hogere niveaus van MHC klasse II en costimulatoire moleculen doen dan pDCs 2. Oudere pDCs, anderzijds, bleken selectieve expressie Siglec-H en BST2 4. Functionally, CDCs beter antigeenpresenterende cellen dan zijn pDCs; kan echter pDCs een grote hoeveelheid type I interferon na virusinfectie of inflammatoire stimulatie 5 produceren.
Zowel CDC en pDCs zijn van korte duur, en daarom moet voortdurend worden aangevuld uit voorlopercellen in het beenmerg (BM) 6,7. Adoptieve overdracht van gewone myeloïde voorlopercellen (CMP) en gebruikelijke lymfoïde voorlopers (CLPs) in lethaal bestraalde muizen toont aan dat CDCs en pDCs kunnen uit beide geslachten 8-10. Er is echter een subset van pDCs die RAG1 / 2 tot expressie en bezitten DJ geherrangschikte segmenten op de IgH locus 11,12. Deze cellen delen ook moleculaire gelijkenissen met B-lymfocyten, met inbegrip van de expressie van de B220 marker, nucleïnezuur sensing receptoren (TLR7 / TLR9), en transcriptiefactoren (SPIB en Bcl11a) 13, voorzien van alle verondersteld om handtekeningen van de lymfoïde afkomst zijn. Daarom CLPs kunnen goede keuzes voor de in vitro generatie van pDCs vanwege afstamming gelijkenis.
Terwijl de frequentie van zowel CDC en pDCs bij mensen en muizen is zeer laag 6, DCs, met name CDCs kan worden gegenereerd in vitro van BM of progenitoren in aanwezigheid van cytokinen, zoals GM-CSF of 11,14 Flt3 ligand (FL ) met behulp van-feeder vrije systemen 11,15,16. Helaas is het niet mogelijk grote aantallen pDCs in vitro gebruik van FL 11,15,16 produceren. Eerder hebben we aangetoond dat pDCs efficiënt kunnen worden gegenereerd in vitro uit CLPs met behulp van de AC-6 feeder-systeem 17. Het voordeel van de AC-6 stromale cellijn in het kweeksysteem is dat het cel-cel contact en uitscheiding van cytokinen die het genereren van grote aantallen pDCs steun van CLPs. Hoewel de productie met dit systeem is zeer robuust, is een zorgvuldige replicatie van de procedures hieronder beschreven vereiste in het oog op een efficiënte opwekking van pDCs garanderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een in vitro kweeksysteem voor de robuuste genereren van DCs en pDCs name uit een klein aantal CLPs. Het unieke van deze cultuur systeem door het gebruik van AC-6 cellen, een stromale cellijn, zoals feeders. Deze benadering is aangetoond dat niet alleen de cytokinen, zoals IL-7, SCF, M-CSF en FL 20 geven, maar ook de cel-cel contact 21 noodzakelijk DC ontwikkeling. AC-6 cellen zijn eerder gebruikt voor de studie van de in vitro DC ontwikkeling van verscheidene …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor Drs. Markus Manz en Irving Weissman voor het verschaffen van reagentia. Wij erkennen ook de dienstverlening van de Flow cytometrische analyse en celsortering Core Facility van de Eerste en Tweede Core Laboratory bij National Taiwan University College of Medicine en NTU ziekenhuis, respectievelijk. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-my3) en de National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI en NHRI-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
References
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
- Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
- Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
- Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
- Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
- Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
- Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
- Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
- Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
- Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
- Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
- Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
- Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
- Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
- Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).
