En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
Células dendríticas plasmacitoides (PDC) son potentes interferón de tipo I (células productoras de IFN-I) que se activan en respuesta a la infección o durante las respuestas inflamatorias. Por desgracia, el estudio de la función PDC se ve obstaculizada por su baja frecuencia en los órganos linfoides, y los métodos existentes para la generación in vitro DC favorecen predominantemente la producción de los CDC sobre PDC. Aquí presentamos un enfoque único para generar eficientemente PDC de progenitores linfoides comunes (CLPS) in vitro. Específicamente, el protocolo descrito detalles cómo purificar CLPs desde la médula ósea y generar PDC por cocultivo con AC-6 células alimentadoras gamma-irradiado en presencia de ligando de Flt3. Una característica única de este sistema de cultivo es que los CLPs migran por debajo de las células AC-6 y se convierten en células de adoquines en la zona de formación de, un paso crítico para la expansión de PDC. Morfológicamente distintos países en desarrollo, a saber, PDC y CDC, se generaron después de aproximadamente 2 semanas con una composición de 70-90% PDC en condiciones óptimas. Típicamente, el número de PDC generados por este método es más o menos 100 veces del número de CLPs sembradas. Por lo tanto, este es un sistema novedoso con el que para generar robustamente el gran número de PDC necesarias para facilitar estudios adicionales en el desarrollo y la función de estas células.
Introduction
Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígeno profesionales que desempeñan un papel importante en el control de las respuestas inmunitarias 1. Mientras que los países en desarrollo son heterogéneos, que se pueden clasificar en dos poblaciones, convencional DC (CDC) y los DC plasmocitoides (PDC) 2,3. Además de los órganos linfoides, CDCs y PDC también se encuentran en tejidos incluyendo pulmón, intestino, piel y 2. La morfología de los CDC y PDC difiere, con CDC expositoras proyecciones dendríticas como y la forma de PDC son como células más plasma. Además, el marcador DC ratón común, CD11c, está más altamente expresado en CDC que en PDC. Por otra parte, CDC puede ser dividida en CD11b + CD24 – CDC y CD11b – CD24 + CDC, los cuales expresan mayores niveles de MHC de clase II y moléculas coestimuladoras que hacen PDC 2. PDC maduros, por otro lado, se ha demostrado para expresar selectivamente Siglec-H y BST2 4. Functionally, CDCs son mejores células presentadoras de antígenos que son PDC; sin embargo, PDC pueden producir una gran cantidad de interferón de tipo I sobre la infección por el virus o la estimulación inflamatoria 5.
Ambos CDC y PDC son de corta duración, y por lo tanto, deben ser constantemente repuestos de progenitores dentro de la médula ósea (MO) 6,7. La transferencia adoptiva de células progenitoras mieloides comunes (CMPS) y progenitores linfoides comunes (CLPS) en ratones letalmente irradiados demuestra que CDCs y PDC pueden ser generados a partir de ambos linajes 8-10. Sin embargo, no es un subconjunto de PDC que expresan RAG1 / 2 y poseen segmentos DJ reordenados el locus IgH en 11,12. Estas células también comparten similitudes moleculares con linfocitos B, incluyendo la expresión del marcador B220, los receptores de ácido nucleico de detección (TLR7 / TLR9), y factores de transcripción (SPIB y BCL11A) 13, todas las características que se cree firmas del linaje linfoide. Por lo tanto, CLPs pueden ser buenas opciones para la generación in vitro de PDC, debido a la similitud linaje.
Si bien la frecuencia de ambos CDCs y PDC en humanos y ratones es muy baja 6, países en desarrollo, en particular los CDC, se puede generar in vitro a partir BM o progenitores en presencia de citoquinas, tales como GM-CSF 11,14 o ligando Flt3 (FL ) utilizando sistemas de alimentación libre de 11,15,16. Desafortunadamente, sin embargo, no es posible producir un gran número de PDC in vitro utilizando FL 11,15,16. Anteriormente hemos demostrado que la PDC se pueden generar de manera eficiente in vitro a partir CLPs utilizando el sistema de alimentación AC-6 17. La ventaja de usar la línea celular estromal AC-6 en el sistema de cultivo es que proporciona contacto célula-célula y la secreción de citocinas que soportan la generación de un gran número de PDC de CLPs. Aunque la producción con este sistema es bastante robusto, i se requiere la replicación cuidadosa de los procedimientos descritos a continuaciónorden n para asegurar la generación eficiente de PDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un sistema de cultivo in vitro para la generación de DCs robusta, y PDC, en particular, a partir de un pequeño número de CLPs. La singularidad de este sistema de cultivo se debe a la utilización de AC-6 células, una línea celular estromal, como alimentadores. Este enfoque ha sido demostrado para proporcionar no sólo las citoquinas, tales como IL-7, SCF, M-CSF y FL 20, sino también el contacto célula-célula 21 necesario para apoyar el desarrollo DC. AC-6 células…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a los Dres. Markus Manz y Irving Weissman para proporcionar reactivos. También reconocemos el servicio prestado por el análisis de citometría de flujo y Cell Sorting Core Instalación de la Primera y Segunda Laboratorio Core en la Universidad Nacional de Taiwán Facultad de Medicina y Hospital NTU, respectivamente. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) y los Institutos Nacionales de Investigación de la Salud, Taiwán (INDH-EX102-10256SI y INDH-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
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