In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
Plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) sind starke Typ I Interferon (IFN-I) Herstellung von Zellen, die in Reaktion auf eine Infektion oder bei entzündlichen Reaktionen aktiviert werden. Leider wird Studium der PDC-Funktion durch ihre niedrigen Frequenz in lymphatischen Organen behindert, und die bestehenden Verfahren zur in-vitro-DC Generation überwiegend zugunsten der Produktion von cDCs über pDCs. Hier präsentieren wir einen einzigartigen Ansatz, um effizient zu erzeugen pDCs von gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) in vitro. Speziell beschriebene Protokolldetails, wie CLPs aus dem Knochenmark zu reinigen und zu erzeugen pDCs kokultiviert mit γ-bestrahlten AC-6-Feeder-Zellen in Gegenwart von Flt3-Liganden. Ein einzigartiges Merkmal dieses Kultursystems ist, dass die CLPs wandern unter den AC-6-Zellen und werden gepflasterten Fläche bildenden Zellen, ein kritischer Schritt zur Erweiterung pDCs. Morphologisch DCs, nämlich pDCs und cDCs wurden mit einer Zusammensetzung aus 7 erzeugte nach ca. 2 Wochen0-90% pDCs unter optimalen Bedingungen. Typischerweise ist die Anzahl der pDCs durch dieses Verfahren erzeugte etwa 100-fachen der Anzahl der CLPs ausgesät. Daher ist dies ein neuartiges System, das eine robuste erzeugen die eine große Zahl von pDCs erforderlich, weitere Untersuchungen über die Entwicklung und Funktion der Zellen zu erleichtern.
Introduction
Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die bei der Kontrolle der Immunantwort 1 eine wichtige Rolle spielen. Während DCs sind heterogen, sie können grob in zwei Populationen klassifiziert werden, herkömmliche DCs (cDCs) und plasmazytoiden DCs (pDCs) 2,3. Zusätzlich zu lymphoiden Organen, sind cDCs und pDCs auch in Geweben, einschließlich Lunge, Darm, Haut und 2 gefunden. Die Morphologie cDCs und pDCs unterscheidet, mit cDCs aufweist Dendriten artigen Vorsprünge und die Form pDCs wobei mehrere Plasmazellenartigen. Darüber hinaus wird der gemeinsame Maus DC Marker, CD11c, stärker auf als auf pDCs cDCs ausgedrückt. CDCs und CD11b – – CD24 + cDCs, die beide exprimieren höhere Niveaus von MHC-Klasse II und kostimulatorische Moleküle als dies pDCs 2 kann darüber hinaus weiter in cDCs CD11b + CD24 teilen. Reife pDCs, andererseits hat sich gezeigt, selektiv auszudrücken Siglec-H und BST2 4. Functionally sind cDCs besser Antigen-präsentierenden Zellen sind als pDCs; jedoch können pDCs eine große Menge an Typ I Interferon bei der Virusinfektion oder entzündlichen Stimulation 5 zu produzieren.
Beide cDCs und pDCs sind kurzlebig und müssen deshalb ständig von Vorläufern im Knochenmark (BM) 6,7 nachgefüllt werden. Adoptiven Transfer von gemeinsamen myeloischer Stammzellen (CMPs) und gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP) in letal bestrahlten Mäusen zeigt, dass cDCs und pDCs kann von beiden Abstammungslinien 8-10 erzeugt werden. Jedoch gibt es eine Untergruppe von pDCs die RAG1 / 2 ausdrücken und besitzen umge DJ Abschnitte der IgH-Locus 11,12. Diese Zellen teilen auch molekulare Ähnlichkeit mit B-Lymphozyten, einschließlich Ausdruck der B220 Marker, Nukleinsäure-Sensing-Rezeptoren (TLR7 / TLR9) und Transkriptionsfaktoren (SPIB und BCL11A) 13, verfügt über alle geglaubt, um Unterschriften der lymphoiden Linie zu sein. Daher CLPs kann eine gute Wahl für in-vitro-Erzeugung von pDCs wegen der Abstammung Ähnlichkeit zu sein.
Während die Frequenz der beiden cDCs und pDCs bei Mäusen und Menschen ist sehr gering 6 DCs, insbesondere cDCs kann in vitro aus BM oder Vorläuferzellen in der Gegenwart von Cytokinen, wie GM-CSF 11,14 oder Flt3-Liganden erzeugt werden (FL ) unter Verwendung von Feederfreie Systeme 11,15,16. Leider ist es jedoch nicht möglich, eine große Anzahl von pDCs in vitro unter Verwendung von FL 11,15,16 herzustellen. Bisher haben wir gezeigt, dass pDCs effizient in vitro aus CLP mit der AC-6 Speisesystem 17 erzeugt werden. Der Vorteil der Verwendung der AC-6 Stromazelllinie im Kultursystem ist, dass er Zell-Zell-Kontakt und die Sekretion von Cytokinen, die die Erzeugung einer großen Zahl von pDCs von CLPs Unterstützung bietet. Obwohl die Produktion mit diesem System ist sehr robust, ist eine sorgfältige Replikation der Verfahren unten beschrieben erforderlich in, um eine effiziente Erzeugung von pDCs gewährleisten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein in-vitro-Kultursystem für die robuste Erzeugung von DCs und pDCs insbesondere aus einer kleinen Anzahl von CLPs. Die Einzigartigkeit dieses Kultursystem ist auf die Verwendung von AC-6-Zellen, eine Stromazelllinie, Speiser. Diese Vorgehensweise hat sich gezeigt, dass nicht nur die Cytokine, wie IL-7, SCF, M-CSF und FL 20 vorzusehen, sondern auch die Zell-Zell-Kontakt 21 notwendig DC Entwicklung zu unterstützen. AC-6 Zellen wurden zuvor verwendet, um die Untersuch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs. Markus Manz und Irving Weissman für die Bereitstellung von Reagenzien. Der Service von der Analyse über Durchflusszytometrie und Zellsortierung Core Facility des ersten und zweiten Kern Laboratory an der National Taiwan University College of Medicine und NTU Krankenhaus zur Verfügung gestellt Wir erkennen auch auf. Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan unterstützt (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) und den Nationalen Gesundheitsforschungsinstitute, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI und NHRI-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
References
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
- Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
- Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
- Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
- Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
- Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
- Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
- Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
- Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
- Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
- Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
- Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
- Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
- Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
- Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).
