In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont de type I puissant interféron (IFN-I) des cellules productrices qui sont activés en réponse à une infection ou au cours des réactions inflammatoires. Malheureusement, l'étude de la fonction PDC est entravé par leur faible fréquence dans les organes lymphoïdes et les méthodes existantes pour vitro génération DC favorise principalement la production des CDC sur les pDC. Ici, nous présentons une approche unique pour générer efficacement des pDC de progéniteurs lymphoïdes communs (cLPS) in vitro. Plus précisément, le protocole décrit les détails comment purifier CLPs de la moelle osseuse et de générer des pDC par co-culture avec AC-6 cellules nourricières gamma-irradiées en présence de ligand Flt3. Une caractéristique unique de ce système de culture est que les PLC migrent au-dessous des cellules AC-6 et deviennent des cellules de la zone formant pavées, une étape cruciale pour l'expansion pDC. PED morphologiquement distinctes, à savoir PDC et les CDC, ont été générés après environ deux semaines avec une composition de 70-90% pDC dans des conditions optimales. En règle générale, le nombre de pDC générés par ce procédé est d'environ 100 fois du nombre de têtes de série PLC. Par conséquent, cela est un nouveau système avec lequel pour générer vigoureusement le grand nombre de pDC nécessaires pour faciliter d'autres études sur le développement et la fonction de ces cellules.
Introduction
Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d'antigène professionnelles qui jouent un rôle important dans le contrôle des réponses immunitaires 1. Alors que les PED sont hétérogènes, ils peuvent être classés en deux populations, les CD classique (CDCS) et DCS plasmacytoïdes (pDC) 2,3. En plus des organes lymphoïdes, CDCS et pDC sont également présents dans les tissus y compris les poumons, l'intestin et de la peau 2. La morphologie du CDCS et pDCs diffère, avec CDCS présentant projections de dendrites-like et la forme des PDC comme étant des cellules plus de plasma. En outre, le marqueur DC de la souris commune, CD11c, est plus fortement exprimé sur CDCS que sur les pDC. En outre, CDC peut encore être divisé en CD11b + CD24 – CDCS et CD11b – CD24 + CDCS, qui expriment toutes deux des niveaux plus élevés de CMH de classe II et molécules costimulatrices que font pDCs 2. PDCs matures, d'autre part il a été démontré, pour exprimer sélectivement Siglec-H et BST2 4. Functionally, CDCS sont meilleures cellules présentatrices d'antigène que sont pDCs; Toutefois, pDCs peuvent produire une grande quantité d'interféron de type I lors de l'infection par le virus ou la stimulation inflammatoire 5.
Les deux CDCS et pDC sont de courte durée, et par conséquent, doivent être constamment reconstituées à partir de progéniteurs dans la moelle osseuse (BM) 6,7. Le transfert adoptif de progéniteurs myéloïdes communs (CMPS) et les progéniteurs lymphoïdes communs (cLPS) dans des souris mortellement irradié démontre que CDCS et pDCs peuvent être générés à partir de deux lignées 8-10. Cependant, il existe un sous-ensemble de pDC qui expriment RAG1 / 2 et possédant des segments réarrangés DJ au locus IgH 11,12. Ces cellules partagent aussi des similitudes moléculaires avec des lymphocytes B, y compris l'expression du marqueur de B220, récepteurs de l'acide détection nucléiques (TLR7 / TLR9), et les facteurs de transcription (SPIB et BCL11A) 13, dispose de tous croit être les signatures de la lignée lymphoïde. Par conséquent, CLPs peut être un bon choix pour la production in vitro de la lignée de pDC parce similitude.
Bien que la fréquence des deux CDCS et pDC chez les humains et les souris est très faible 6, les DC, en particulier CDCS, peut être produite in vitro à partir de progéniteurs BM ou en présence de cytokines, telles que GM-CSF ou le ligand Flt3 11,14 (FL ) en utilisant des systèmes sans cellules nourricières 11,15,16. Malheureusement, il est impossible de produire un grand nombre de pDC in vitro utilisant FL 11,15,16. Auparavant, nous avons démontré que les pDC peuvent être générées de manière efficace in vitro de PLC au moyen du système d'alimentation AC-17 6. L'avantage d'utiliser la lignée cellulaire stromale AC-6 dans le système de culture est que cela permet un contact cellule-cellule et sécrétion de cytokines qui favorisent la production d'un grand nombre de pDC à partir de PLC. Bien que la production de ce système est très robuste, la réplication attentif des procédures décrites ci-dessous est nécessaire in Afin d'assurer la production efficace des PDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons un système in vitro en culture pour la génération robuste des pays en développement, et en particulier les pDC, à partir d'un petit nombre de CLP. Le caractère unique de ce système de culture est due à l'utilisation de l'AC-6, les cellules d'une lignée cellulaire stromale, en tant que dispositifs d'alimentation. Cette approche a été montré pour fournir non seulement les cytokines, telles que IL-7, SCF, M-CSF et FL 20, mais aussi le contact…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à MM. Markus Manz et Irving Weissman pour fournir des réactifs. Nous reconnaissons également le service fourni par la cytométrie en flux et l'analyse cellulaire tri de base Fonds de la première et deuxième laboratoire de base à la National Taiwan University College de l'hôpital de médecine et NTU, respectivement. Ce travail a été soutenu par le Ministère de la Science et de la Technologie, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) et les Instituts nationaux de recherche en santé, Taiwan (INDH-EX102-10256SI et INDH-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
References
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
- Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
- Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
- Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
- Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
- Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
- Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
- Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
- Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
- Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
- Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
- Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
- Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
- Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
- Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).
