AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
Plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) I enfeksiyona veya enflamatuar yanıtlar sırasmda yanıt olarak aktive olmuş (IFN-I) üreten hücreler interferon güçlü bir tipidir. Ne yazık ki, pDC fonksiyonunun çalışma lenfoid organlarda düşük frekansta tarafından engellenmektedir, in vitro DC nesil için mevcut yöntemler ağırlıklı pDC'lerde üzerinde CDCS üretimini tercih. İşte biz verimli in vitro ortak lenfoid atalarıdır (CLPs) den PDC oluşturmak için benzersiz bir yaklaşım sunuyoruz. Spesifik olarak, iletişim kuralı, kemik iliğinden CLPs arındırmak ve Flt3 ligand mevcudiyetinde γ-ışınlanmış AC-6 besleyici hücreler ile coculturing ile PDC oluşturmak için nasıl ayrıntıları açıklanan. Bu kültür sisteminin benzersiz özelliği CLPs AC-6 hücreleri altında göç ve Arnavut kaldırımlı alan oluşturan hücreler, PDC genişletilmesi için kritik bir adım haline olmasıdır. Morfolojik olarak farklı DCler, yani PDC ve CDCS 7, bir bileşim ile yaklaşık 2 hafta sonra elde edildiOptimal koşullarda% 0-90 PDC. Tipik olarak, bu yöntemle üretilen pDC'lerde sayısı kabaca tohumlu CLPs sayısı 100 mislidir. Bu nedenle, bu sağlam bu hücrelerin gelişimi ve fonksiyonu içine daha ileri çalışmalar kolaylaştırmak için gereklidir pDC'lerde sayıda üretmek için hangi yeni bir sistemdir.
Introduction
Dendritik hücreler (DC) bağışıklık tepkilerini 1 kontrolünde önemli bir rol oynamaktadır profesyonel antijen sunan hücrelerdir. DH'ler, heterojen olsa da, genel olarak iki popülasyon olarak sınıflandırılabilir, konvansiyonel DCler (CDCS) ve plazmasitoid DCler (PDC) 2,3. Lenfoid organlara ek olarak, CDCS ve PDC aynı zamanda, akciğer, bağırsak, deri 2 dahil olmak üzere dokuların bulunurlar. CDCS ve pDC'lerde morfolojisi dendrit gibi projeksiyonlar ve daha plazma hücre benzeri olma pDC'lerde şeklini gösteren CDCS ile farklıdır. Buna ek olarak, ortak bir fare DC markör, CD11c, daha çok pDC'lerde göre daha CDCS üzerinde ifade edilir. PDC 2 için, MHC sınıf II yüksek seviyeleri ve kostimülatör moleküller, her ikisi de CD24 + CDCS, – CDCS ve CD11b – Ayrıca, CDCS daha CD11b + CD24 ayrılabilir. Olgun PDC, diğer yandan, selektif Siglec-H ve BST2 4 ifade ettiği gösterilmiştir. Functionally, CDCS PDC olduğundan daha sunan hücrelerin iyi antijen; Ancak, PDC Ben virüs enfeksiyonu veya enflamatuar stimülasyon 5 üzerine interferon türü geniş bir miktarda üretebilir.
Her iki CDCS ve PDC kısa ömürlü olduğu ve bu nedenle, sürekli kemik iliği (BM) 6,7 içindeki progenitörlerinden doldurulan olmalıdır. Öldürücü ışınlanmış farelere sık miyeloid progenitör (cmps) ve ortak lenfoid progenitörleri (CLPs) adoptif nakli CDCS ve PDC her iki soy 8-10 elde edilebileceğini göstermektedir. Ancak, RAG1 / 2 ifade ve IgH lokus 11,12 olarak yeniden düzenlenmiş DJ kesimleri sahip pDC'lerde bir alt kümesi vardır. Bu hücreler, aynı zamanda B220 işaretleyicinin ifadesi, bir nükleik asit-algılama reseptörleri (TLR7 / TLR9) ve transkripsiyon faktörlerinin (SPIB ve Bcl11a) 13 de dahil olmak üzere B limfositleri üzerinde, moleküler benzerlikler, lenfoid imzaları olduğuna inanılmaktadır tüm sahiptir. Bu nedenle, CLPs nedeniyle soy benzerlik pDC'lerde in vitro nesil için iyi seçimler olabilir.
İnsanlarda ve farelerde hem CDCS ve pDC'lerde sıklığı çok düşük olsa da 6 DH'ler, özellikle de CDCS (örneğin, GM-CSF ya da 11,14 Flt3 ligandı gibi sitokinlerin mevcudiyetinde BM ya da progenitörlerinden in vitro üretilebilir FL ) besleyici içermeyen sistemler kullanılarak 11,15,16. Ancak ne yazık ki, bu FL 11,15,16 kullanılarak in vitro pDC'lerde sayıda üretilmesi mümkün değildir. Daha önce PDC verimli AC-6 besleme sistemi 17 kullanarak CLPs in vitro olarak üretilebilir olduğunu gösterdi. Kültür sisteminde AC-6 stromal hücre çizgisi kullanılarak avantajı, hücre-hücre temas ve CLPs gelen pDC'lerde çok sayıda üretilmesini destekleyen sitokinlerin salgılanmasını sağlamasıdır. Bu sistem ile, üretim oldukça sağlamdır olmasına rağmen, aşağıda anlatılan prosedürlerin dikkat çoğaltma i gereklidirn emri pDC'lerde verimli nesil sağlamak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada CLPs küçük bir sayı, özellikle bir in vitro kültür DClerin sağlam oluşturulması için bir sistem ve PDC tarif eder. Bu kültür sisteminin benzersiz besleyici olarak AC-6 hücreleri, stromal hücre çizgisi, kullanımına bağlıdır. Bu yaklaşım, IL-7, SCF, M-CSF ve FL 20 gibi yalnızca sitokinleri sağladığı gösterilmiştir, ancak, aynı zamanda, gerekli hücre-hücre teması 21 DC gelişimini desteklemek. AC-6 hücreler, birkaç progenitörlerin 8,16,22…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederiz. Belirteçlerin temin Markus Manz ve Irving Weissman. Biz de sırasıyla Tıp ve NTU hastanenin Ulusal Tayvan Üniversitesi Koleji'nde Akış Sitometrik Analizi ve Birinci Hücre Sıralama Çekirdek Tesisi ve İkinci Çekirdek Laboratuvarı tarafından sağlanan hizmeti kabul. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji, Tayvan Bakanlığı tarafından desteklenen (EN 102-2320-B-002-030-My3) ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri, Tayvan (IHUK-EX102-10256SI ve IHUK-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
References
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
- Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
- Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
- Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
- Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
- Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
- Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
- Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
- Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
- Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
- Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
- Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
- Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
- Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
- Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).
