In Vitro Generering av murine Plasmacytoid dendrittiske celler fra Common Lymfoid stamfedre bruker AC-6 Feeder System
Summary
In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.
Abstract
Plasmacytoid dendrittiske celler (PDCs) er kraftig type I interferon (IFN-I) produserende celler som aktiveres som respons på infeksjon eller ved inflammatoriske responser. Dessverre studie av PDC-funksjonen er hindret av deres lave frekvensen i lymfoide organer, og eksisterende metoder for in vitro DC generasjon overveiende favorisere produksjon av CDCs løpet PDCs. Her presenterer vi en unik tilnærming til effektivt å generere PDCs fra vanlige lymfoide stamfedre (CLPs) in vitro. Nærmere bestemt protokollen beskrevet detaljer hvordan man skal rense CLPs fra benmarg og generere PDCs ved coculturing med y-bestrålte AC-6 feeder-celler i nærvær av Flt3-ligand. En unik egenskap ved denne kulturen systemet er at CLPs migrere under AC-6 celler og bli brosteins området dannende celler, et avgjørende skritt for å utvide PDCs. Morfologisk forskjellige DC, nemlig PDCs og CDCS, ble generert etter ca 2 uker med en sammensetning av 70-90% PDCs under optimale forhold. Vanligvis er antallet PDCs som genereres ved denne fremgangsmåten omtrent 100 ganger av antall CLPs seeded. Derfor er det et nytt system som brukes til å generere robuste store antall PDCs som kreves for å legge til rette for ytterligere studier, og i utvikling og funksjon av disse cellene.
Introduction
Dendrittiske celler (DCS) er profesjonell antigen-presenterende celler som spiller en viktig rolle i å kontrollere en immunresponser. Mens DC er heterogene, de kan grovt deles inn i to populasjoner, konvensjonell DC (CDCS) og plasmacytoid DC (PDCs) 2,3. I tillegg til lymfoide organer, er CDCS og PDCs også funnet i vev innbefattende lunge, tarm, hud og 2. Morfologi CDCS og PDCs forskjellig, med CDCS utviser dendrite-lignende anslag og formen på PDCs blir mer plasma celle-lignende. I tillegg er det vanlig mus DC markør, CD11c, mer sterkt uttrykt på CDCS enn på PDCs. Videre kan CDCS videre deles inn CD11b + CD24 – CDCs og CD11b – CD24 + CDCS, som begge uttrykker høyere nivåer av MHC klasse II og samtidig stimulerende molekyler enn gjøre PDCs 2. Modne PDCs, på den annen side, har vist seg selektivt å uttrykke Siglec-H og BST2 4. Functionally, CDCS er bedre antigenpresenterende celler enn er PDCs; men kan PDCs produsere en enorm mengde av type I interferon på virus infeksjon eller inflammatorisk stimulering 5.
Begge CDCS og PDCs er kortvarige, og derfor må stadig etterfylles fra stamfedre i benmargen (BM) 6,7. Adoptiv overføring av felles myeloide stamceller (CMPS) og vanlige lymfoide progenitors (CLPs) inn lethally-bestrålte mus viser at CDCS og PDCs kan genereres fra begge linjene 8-10. Imidlertid er det en undergruppe av PDCs som uttrykker RAG1 / 2 og besitter rearrangerte DJ segmenter ved avIgH locus 11,12. Disse cellene deler også molekylære likheter med B-lymfocytter, inkludert uttrykk for B220 markør, nukleinsyre-sensing reseptorer (TLR7 / TLR9), og transkripsjonsfaktorer (SPIB og Bcl11a) 13, har alle antas å være underskrifter fra lymfoidlinjen. Derfor CLPs kan være gode valg for in vitro generasjon PDCs grunn av avstamning likheten.
Mens frekvensen av både CDCS og PDCs i mennesker og mus er meget lav 6, DC, særlig CDCS, kan genereres in vitro fra BM eller progenitorceller i nærvær av cytokiner, slik som GM-CSF 11,14 eller Flt3-ligand (FL ) bruker mater frie systemer 11,15,16. Dessverre er det imidlertid ikke mulig å fremstille et stort antall PDCs in vitro ved hjelp av FL 11,15,16. Tidligere har vi vist at PDCs effektivt kan genereres in vitro fra CLPs bruker AC-6 mater system 17. Fordelen med å bruke en AC-6 stromal cellelinjen i kultursystemet er at det gir celle-celle-kontakt og sekresjon av cytokiner som støtter generering av et stort antall PDCs fra CLPs. Selv om produksjonen med dette systemet er ganske robust, er forsiktig replikering av prosedyrene som er beskrevet nedenfor kreves in For å sikre effektiv generasjon PDCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi et in vitro kultursystem for robust generering av DC, og PDCs spesielt fra et lite antall CLPs. Det unike med dette kultursystem er på grunn av bruk av AC-6-celler, en cellelinje stromal, som forer. Denne metoden har vist seg å tilveiebringe ikke bare cytokiner, slik som IL-7, SCF, M-CSF, og FL 20, men også den celle-celle-kontakt 21 er nødvendig for å understøtte utvikling DC. AC-6 celler har blitt brukt tidligere for å lette studiet av in vitro DC utvikli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for legene. Markus Manz og Irving Weissman for å gi reagenser. Vi erkjenner også tjenesten leveres av Flowcytometriske Analyse og Cell Sorting Kjerne Facility av første og andre Kjernelaboratoriet ved National Taiwan University College of Medicine og NTU sykehus, henholdsvis. Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (MEST 102-2320-B-002-030-My3) og National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI og NHRI-EX103-10256SI).
Materials
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
References
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
- Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
- Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
- Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
- Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
- Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
- Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
- Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
- Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
- Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
- Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
- Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
- Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
- Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
- Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).
