JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

I vitro Generation av murina Plasmacytoid dendritiska celler från Common lymfoid stamfäder med hjälp av AC-6 Feeder System

Published: November 23, 2015
doi:
10.3791/53211
, ,
1Graduate Institute of Immunology,National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Biochemistry,Chang Gung University College of Medicine, 3Molecular Medicine Research Center,Chang Gung University College of Medicine

Summary

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Abstract

Plasmacytoid dendritiska celler (pDCs) är kraftfulla typ I interferon (IFN-I) producerande celler som aktiveras som svar på infektion eller under inflammatoriska svar. Tyvärr är studiet av PDC-funktionen hindras av deras låga frekvens i lymfoida organ och befintliga metoder för in vitro DC generation gynnar främst produktionen av CDCs över pDCs. Här presenterar vi en unik metod för att effektivt generera pDCs från vanliga lymfoida stamceller (CLPS) in vitro. Specifikt beskrev protokollet beskriver hur du renar CLPS från benmärg och generera pDCs genom samodling med y-bestrålade AC-6 feeder-celler i närvaro av Flt3 ligand. En unik egenskap hos denna kultur systemet är att CLPS migrerar under AC-6-celler och bli gatsten område bildande celler, ett viktigt steg för att expandera pDCs. Morfologiskt distinkta DC, nämligen pDCs och CDCs, genererades efter ca 2 veckor med en sammansättning av 70-90% pDCs under optimala förhållanden. Typiskt är antalet pDCs som genereras genom detta förfarande ungefär 100-faldigt av antalet CLPS sådda. Därför är detta ett nytt system som man kraftfullt generera ett stort antal pDCs för att underlätta fortsatta studier i utvecklingen och funktionen hos dessa celler.

Introduction

Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler som spelar en viktig roll i att kontrollera immunsvar 1. Medan utvecklingsländerna är heterogena, kan de i stort sett delas in i två populationer, konventionell DCs (CDCs) och plasmacytoid DC (pDCs) 2,3. Förutom lymfoidorgan är CDCs och pDCs också i vävnader inklusive lungor, tarm och hud 2. Morfologin hos CDCs och pDCs skiljer, med CDCs uppvisar dendritliknande liknande utsprång och formen på pDCs är mer plasmacell-liknande. Dessutom är den gemensamma mus DC markör, CD11c, högre uttryckt på CDCs än på pDCs. Dessutom kan CDCs delas upp ytterligare i CD11b + CD24 – CDCs och CD11b – CD24 + CDCs, vilka båda uttrycker högre nivåer av MHC klass II och samstimulerande molekyler än gör pDCs 2. Mogna pDCs, å andra sidan, har visats att selektivt uttrycka Siglec-H och BST2 4. Functionally, CDCs är bättre antigenpresenterande celler än är pDCs; kan dock pDCs producera en stor mängd typ I interferon på virusinfektion eller inflammatorisk stimulering 5.

Både CDCs och pDCs är kortlivade, och därför måste ständigt fyllas från stamceller i benmärgen (BM) 6,7. Adoptiv överföring av gemensamma myeloida stamceller (CmpS) och de gemensamma lymfoida progenitorceller (CLPS) i letalt bestrålade möss visar att CDCs och pDCs kan genereras från båda linjerna 8-10. Det finns dock en delmängd av pDCs som uttrycker RAG1 / 2 och besitter omlagrade DJ segment på IgH-locuset 11,12. Dessa celler delar också molekylära likheter med B-lymfocyter, inklusive uttryck av B220 markör, nukleinsyra kännande receptorer (TLR7 / TLR9), och transkriptionsfaktorer (SPIB och Bcl11a) 13, har alla tros vara underskrifter lymfoida. Därför CLPs kan vara bra val för in vitro generation pDCs grund av härstamning likhet.

Medan frekvensen av både CDCsen och pDCs hos människor och möss är mycket låg 6, DCs, särskilt CDCs, kan genereras in vitro från BM eller progenitorer i närvaro av cytokiner, såsom GM-CSF 11,14 eller Flt3-ligand (FL ) med hjälp av matarfria system 11,15,16. Olyckligtvis är det emellertid inte möjligt att framställa ett stort antal pDCs in vitro med användning FL 11,15,16. Tidigare visade vi att pDCs effektivt kan genereras in vitro från CLPS med hjälp av AC-6 matningssystemet 17. Fördelen med att använda en AC-6 stromala cellinje i odlingssystemet är att det ger cell-cellkontakt och utsöndring av cytokiner som stödjer generering av stora antal pDCs från CLPS. Även om produktion med detta system är ganska robust, noggrann replikering av de förfaranden som beskrivs nedan krävs iör att säkerställa en effektiv generering av pDCs.

Protocol

C57BL / 6 vildtypsmöss köptes från National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Alla möss avlades och hölls under specifika patogenfria betingelser. Protokoll och förfaranden användning av djur har granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av National Taiwan University College of Medicine (Tillståndsnummer: 20120075). Dessutom forskarna gjorde allt för att minska risken för smärta, lidande eller ångest hos djuren när de utför experiment. Alla förfaranden som beskrivs genomfördes vid…

Representative Results

Totalt 4-6×10 7 BM-celler isoleras typiskt från lårben och skenben av ett 6-8 wk-old, vildtyp C57BL / 6-mus. För att reda ut CLPS de totala BM-celler färgades med PE-konjugerade antikroppar mot linjemarkörer (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 och MHC-II), anti -c-kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC och anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analyseras och sorteras med en cellsorterare. Sorteringsstrategin för CLP visas i figur 1. Normalt är 5×10 …

Discussion

Här beskriver vi ett in vitro-odlingssystem för den robusta generationen DC och pDCs i synnerhet från ett litet antal CLPS. Det unika med denna odlingssystemet är på grund av användningen av AC-6-celler, en stromala cellinje, som matare. Detta tillvägagångssätt har visat sig ge inte bara de cytokiner, såsom IL-7, SCF, M-CSF och FL 20, men också den cell-cellkontakt 21 nödvändigt för att stödja DC utveckling. AC-6-celler har tidigare använts för att underlätta studier av <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi är tacksamma för Dr.. Markus Manz och Irving Weissman för åstad reagens. Vi erkänner också den tjänst som tillhandahålls av flödescytometrisk analys och cellsortering Core Facility av första och andra kärn Laboratory vid National Taiwan University College of Medicine och NTU sjukhus, respektive. Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (MEST 102-2320-B-002-030-My3) och de nationella Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI och NHRI-EX103-10256SI).

Materials

Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).

Tags

Plasmacytoid Dendritic CellsPDCsCommon Lymphoid ProgenitorsCLPsAC-6 Feeder SystemIn Vitro GenerationType I InterferonIFN-ICDCs
check_url/53211?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chang, S., Pai, L., Lee, C. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image