En optimeret fremgangsmåde til isolering og udvidelse Invariant Natural Killer T-celler fra musemilt
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
Evnen til hurtigt at udskille cytokiner ved stimulering er en funktionel egenskab ved den invariante naturlige killer T (iNKT) cellelinie. iNKT celler er derfor karakteriseret som en medfødt T-cellepopulation stand til at aktivere og styre adaptive immunresponser. Udviklingen af forbedrede teknikker til kultur og udvidelse af murine iNKT celler letter studiet af iNKT cellebiologi i in vitro og in vivo modelsystemer. Her beskriver vi en optimeret procedure til isolering og ekspansion af murine milt iNKT celler.
Milt fra C57BL / 6-mus er fjernet, dissekeret og anstrengt og den resulterende cellulære suspension lag over densitetsgradient medier. Efter centrifugering er milt mononukleære celler (MNCs) indsamles og CD5-positive (CD5 +) lymfocytter beriges for anvendelse af magnetiske perler. iNKT celler i CD5 + fraktionen farves efterfølgende med ^5, GalCer-loaded CD1d tetramer og oprenset ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). FACS sorteret iNKT celler derefter oprindeligt dyrket in vitro under anvendelse af en kombination af rekombinante murine cytokiner og pladebundet T-cellereceptor (TCR) stimuli inden udvides i nærvær af murine rekombinant IL-7. Med denne teknik, cirka 10 8 iNKT celler kan genereres inden 18-20 dages dyrkning, hvorefter de kan anvendes til funktionelle assays in vitro, eller til in vivo kan overføres eksperimenter i mus.
Introduction
Murine invariant naturlige dræberceller T (iNKT) celler er en særskilt population af medfødte T-lymfocytter er valgt i thymus ved CD1d-udtrykkende kortikale thymocytter 1,2. iNKT celler udtrykker en T-cellereceptor (TCR), der består af et invariant Vα14-Jα18 TCR-kæde parret med enten Vβ8, Vβ7 eller Vβ2 TCR'er 3, som er i stand til at genkende endogent samt udenlandske lipid antigener i forbindelse med CD1d. For eksempel genkender murine iNKT celler og aktiveres af et endogent antigen kaldet lipid isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, samt α-galactosylceramid (αGalCer) 5,6, et glycolipid isoleret fra marine svampe. TCR-afhængige aktivering af iNKT celler fremmer priming af adaptive immunresponser, og som følge heraf, har iNKT celler vist sig at være funktionelt involveret i bedring eller udvikling af en række af patologier, herunder reumatiske sygdomme 7 og kræft <sup> 8. I øjeblikket, syntetiske iNKT celle ligander udgør lovende nye vaccineadjuvanser, der kan være i stand til at regulere en række immunopatologiske betingelser.
Det er tidligere blevet påvist, at iNKT celler kan genereres in vitro efter isolering fra muse væv dog; mange af disse undersøgelser ansætte brugen af primære antigenpræsenterende celler (APC'er) og / eller cellelinier 9, Vα14 TCR transgene (Tg) mus 10 eller thymomer til generering af iNKT celleafledte hybridomer 11,12. Desuden stort antal mus, store mængder af reagenser, såsom αGalCer-loaded CD1d dimerer, og lange dyrkningstider foretage nogle publicerede protokoller mindre etisk og økonomisk tiltrækkende 9,13.
I denne rapport beskriver vi en tilpasset fremgangsmåde til isolering og in vitro udvidelse af iNKT celler fra muse milt. Mere specifikt protokollen beskriver en fremgangsmådetil berigelse iNKT celler fra musemilt hvilket reducerer mus, reagenser og kræve længere tid til FACS cellesortering, og foreslår en optimeret tilgang for at udvide sorterede milt iNKT celler in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i den nuværende protokol omfatter isolering og efterfølgende berigelse af CD5 + lymfocytter (Afsnit 1 & 2), FACS sortering (afsnit 3) og den indledende udpladning af iNKT celler (afsnit 4). Af de trin, der udføres i afsnit 1, så husk at omhyggeligt lag den milten cellulære suspension over densitetsgradient medium, således at en distinkt cellulær interfase genereres efter centrifugering. Den efterfølgende berigelse for CD5 + lymfocytter ved magnetisk celleseparation (afsnit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
