Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
A capacidade de secretar citocinas rapidamente com a estimulação é uma característica funcional da invariante natural killer T (iNKT) linhagem celular. iNKT células são portanto caracterizado como uma população de células T capazes de activar inata e adaptativa direcção respostas imunes. O desenvolvimento de técnicas melhoradas para a cultura e expansão de células iNKT murino facilita o estudo de biologia celular iNKT in vitro e em sistemas modelo in vivo. Aqui, descrevemos um processo aperfeiçoado para o isolamento e a expansão de células esplénicas murinas iNKT.
Os baços de ratinhos C57BL / 6 são removidos, dissecados e tenso e a suspensão celular resultante é colocado em camadas sobre meios de gradiente de densidade. Após centrifugação, as células mononucleares esplénicas (MNCs) são recolhidos e linfócitos CD5-CD5 positivas (+) são enriquecidos para usando esferas magnéticas. iNKT células dentro da fracção CD5 + são subsequentemente corados com ^5; GalCer-carregado CD1d tetrâmero e purificou-se por selecção de células activadas de fluorescência (FACS). Separadas por FACS, em seguida, as células são iNKT inicialmente cultivadas in vitro, utilizando uma combinação de citocinas recombinantes de murideo e receptor de células T de placa ligado (TCR), antes de ser expandido estímulos em presença de murino IL-7 recombinante. Usando esta técnica, aproximadamente 10 8 iNKT células pode ser gerada dentro de 18-20 dias de cultura, após o que eles podem ser utilizados para ensaios funcionais in vitro, ou para experiências in vivo em ratinhos de transferência.
Introduction
Murino células T assassinas naturais invariante (iNKT) são uma população distinta de linfócitos T inatas selecionados no timo por expressando CD1d timócitos corticais 1,2. iNKT células expressam um receptor de células T (TCR) composta de uma cadeia Vα14-Jα18 TCR invariante emparelhado com qualquer Vβ8, Vβ7 Vβ2 TCRs ou 3, que é capaz de reconhecer endógena, bem como os antigénios de lípidos estranhos no contexto da CD1d. Por exemplo, células de murino iNKT reconhecer e são activados por um chamado lípido isoglobotrihexosylceramide antigénio endógeno (iGb3) 4, bem como α-galactosilceramida (αGalCer) 5,6, um glicolípido isolado a partir de esponjas marinhas. TCR-dependente de activação de células iNKT promove a iniciação de respostas imunitárias adaptativas, e como um resultado, as células iNKT foram mostrados para ser funcionalmente envolvidos na melhoria ou o desenvolvimento de uma variedade de patologias incluindo a doença reumática 7 e cancro <sup> 8. Actualmente, os ligandos celulares iTNK sintéticos constituem novos adjuvantes de vacinas promissoras, que podem ser capazes de regular a um número de condições imunopatológicas.
Foi previamente demonstrado que as células iNKT podem ser gerados in vitro após isolamento a partir de tecido de rato no entanto; muitos destes estudos emprega a utilização de células primárias de apresentação de antigénio (APCs) e / ou linhas de células 9, Vα14 TCR transgénicos (Tg) de 10 ratinhos, timomas ou para a geração de iNKT derivadas de células hibridomas 11,12. Além disso, um grande número de ratos, altos volumes de reagentes, tais como dímeros CD1d αGalCer-carregados, e tempos de cultivo longas fazer alguns protocolos publicados há menos de forma ética e economicamente atraente 9,13.
Neste relatório nós descrevemos um método adaptado para o isolamento e expansão in vitro de células de rato iNKT baço. Mais especificamente, o protocolo descreve um métodopara o enriquecimento de células de baço de ratinho iNKT que reduz os ratos, os reagentes e tempo necessários para FACS separação de células, e propõe uma abordagem otimizada para expansão de células esplênicas iNKT ordenados in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas do protocolo atual incluem o isolamento e enriquecimento posterior de CD5 + linfócitos (Seção 1 & 2), FACS classificação (Seção 3) eo revestimento inicial de células iNKT (Seção 4). Dos passos realizados na Seção 1, lembre-se para a camada cuidadosamente a suspensão celular splenic a médio gradiente de densidade tal que uma interfase celulares distintos é gerado após a centrifugação. O enriquecimento posterior para CD5 + linfócitos por separação magnética …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
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