Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
Hızla stimülasyon üzerine sitokinleri yeteneği değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücre soyunun işlevsel bir özelliğidir. iNKT hücreler bu bağışıklık yanıtlarını aktive ve direksiyon adaptif yeteneğine sahip doğuştan gelen bir T hücresi popülasyonu olarak karakterize edilir. Murin iNKT hücrelerin kültürü ve genişleme için geliştirilmiş tekniklerin geliştirilmesi, in vitro ve in vivo model sistemlerinde de iNKT hücre biyolojisi üzerinde çalışmayı kolaylaştırmaktadır. Burada, izolasyon ve murin splenik iNKT hücrelerinin genişlemesi için optimize edilmiş bir prosedürü açıklar.
C57BL / 6 farelerinden alınan dalak çıkarılır, parçalara ayrılır ve süzülmüş ve elde edilen hücresel süspansiyon yoğunluk gradyan ortam üzerine yayıldı edilir. Santrifüj sonrasında, dalak mononükleer hücreler (MNC) toplanır ve CD5-pozitif (CD5 +) lenfositler manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirilmiştir. CD5 + fraksiyonu içinde iNKT hücreler daha sonra ^ ile boyanır5; CD1d tetramer GalCer yüklenmiş ve flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile saflaştırılmıştır. FACS murin yeniden birleştirici IL-7 varlığında genişletilmiş önce rekombinan sıçangil sitokin ve plaka bağlı T hücresi reseptörü (TCR) uyaran bir kombinasyonu kullanılarak iNKT hücreleri başlangıçta daha sonra in vitro olarak kültürlenir kriteri. Yaklaşık 10 8 iNKT hücreleri in vitro fonksiyonel deneyleri için ya da farelerde in vivo transfer deneyleri için de kullanılabilir ve bundan sonra kültür 18-20 gün içinde elde edilebilir Bu tekniği kullanarak.
Introduction
Mürin değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri CD1d-ifade kortikal timositleri 1,2 ile timus seçilen doğuştan T lenfositlerinin farklı bir nüfus vardır. iNKT hücreleri Vβ8, Vβ7 ya CD1d bağlamında endojen yanı sıra dış lipid antijenlerini tanıma yeteneğine sahip olan Vβ2 TCRler 3 ya ile eşleştirilmiş değişmeyen bir Vα14-Jα18 TCR zinciri içeren bir T hücre reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Örneğin, kemirgen iNKT hücreleri tanıyan ve endojen yağ antijen olarak adlandırılan isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, hem de α-galaktozilseramid (αGalCer) 5,6, deniz süngerlerinden izole edilen bir glikolipid ile aktive edilir. TCR bağımlı <iNKT hücrelerinin aktivasyonu adaptif bağışıklık tepkilerinin teşvik hazırlanmasını, ve bunun sonucu olarak, iNKT hücreleri romatizmal hastalık 7 ve kanser dahil patolojilerin bir dizi iyileştirilmesi ya da geliştirme işlevsel olarak ilgili olduğu gösterilmiştirsup> 8. Şu anda, sentetik iNKT hücre ligandlar immünopatolojik koşulları bir dizi düzenleme yeteneğine sahip olabilir umut vadeden yeni bir aşı yardımcı maddeleri oluşturmaktadır.
Bu, daha önce iNKT hücreleri, ancak fare dokusundan izole aşağıdaki in vitro üretilebilir olduğu ortaya konmuştur; Bu çalışmaların bir çoğunda primer antijen sunan hücreler (APC'ler) ve / veya hücre çizgileri 9 kullanımından yararlanmakta, Vα14 TCR transjenik (Tg) iNKT-hücresinden alınan hibridomadan 11,12 üretimi için farenin 10 veya timomalar. Bundan başka, farelerin çok sayıda, örneğin αGalCer yüklü CD1d dimerler ve uzun kültür zamanlarında gibi reaktiflerin yüksek hacimli bir yayınlanmış protokoller az etik ve ekonomik 9,13 çekici hale.
Bu yazıda izolasyon ve fare dalak iNKT hücrelerin in vitro genişlemesi uyarlanmış bir yöntem tarif eder. Daha özel olarak ise, Protokol bir yöntem tarifFACS hücre sıralama için gerekli fareler, reaktifler ve süresini azaltır, ve in vitro sıralanan dalak iNKT hücrelerini genişletilmesi için optimize edilmiş bir yaklaşım önermektedir fare dalak iNKT hücrelerini zenginleştirmek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçerli protokol kritik adımlar izolasyon ve CD5 + lenfositlerin (Bölüm 1 ve 2) sonraki zenginleştirme, FACS sıralama (Bölüm 3) ve iNKT hücrelerinin ilk kaplama (Bölüm 4) yer alıyor. Bölüm 1'de gerçekleştirilen adımların dikkatle ayrı bir hücresel interfaz santrifüj takip üretildiği şekilde yoğunluk gradyan ortamı üzerinden dalak hücresel süspansiyon katman unutmayın. Manyetik hücre ayırma (Bölüm 2) tarafından CD5 + lenfositlerin müteakip zenginleştirme leke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
