שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
היכולת להפריש ציטוקינים במהירות על גירוי היא מאפיין פונקציונלי של שושלת תא רוצח טבעי T (iNKT) בלתי משתנה. תאי iNKT לכן מאופיינים כאוכלוסיית תא מולדת T מסוגלת הפעלה והסתגלות היגוי תגובות חיסונית. הפיתוח של טכניקות משופרות לתרבות והרחבת תאי iNKT עכברי מאפשר המחקר של ביולוגיה של תא iNKT במבחנה ובמערכות מודל vivo. כאן אנו מתארים הליך מותאם לבידוד והרחבת תאי iNKT הטחול עכברי.
טחול מעכברי C57Bl / 6 יוסרו, גזור ומתוח וההשעיה הסלולרית וכתוצאה מכך היא שכבות על תקשורת שיפוע צפיפות. בעקבות צנטריפוגה, תאי הטחול mononuclear (MNCs) נאספים וימפוציטים CD5-חיוביים (CD5 +) מועשרים לשימוש בחרוזים מגנטיים. תאי iNKT בתוך שבריר CD5 + מוכתמים לאחר מכן עם ^עמוס GalCer tetramer CD1d ומטוהר על ידי תא הקרינה מיון מופעל (FACS); 5. FACS מיון תאי iNKT אז הם בתחילה בתרבית במבחנה באמצעות שילוב של ציטוקינים עכברי רקומביננטי וגירויים קולט תא T צלחת מאוגד (TCR) לפני שהרחיב בנוכחות של IL-7 רקומביננטי עכברי. שימוש בטכניקה זו, כ יכולים להיות שנוצרו 10 8 תאי iNKT בתוך 18-20 ימים של תרבות, לאחר שהם יכולים לשמש עבור מבחני פונקציונליים במבחנה, או לin vivo ניסויי העברה בעכברים.
Introduction
Murine T תאים (iNKT) רוצח טבעי משתנה הם אוכלוסייה מובחנת של לימפוציטים מסוג T המולדים נבחר בהתימוס ידי thymocytes קליפת המוח להביע CD1d 1,2. תאי iNKT לבטא קולט תא T (TCR) מורכבים משרשרת Vα14-Jα18 TCR משתנה יחד עם שני Vβ8, Vβ7 או Vβ2 TCRs 3, שהוא מסוגל להכיר אנדוגני כמו גם אנטיגנים שומנים זרים בהקשר של CD1d. לדוגמא, תאי iNKT עכברי להכיר ומופעלים על ידי isoglobotrihexosylceramide אנטיגן השומנים אנדוגני נקרא (iGb3) 4, כמו גם α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, גליקוליפיד מבודד מספוגים ימיים. TCR-תלויה הפעלת תאי iNKT מקדם תחול של תגובות חיסוניים אדפטיבית, וכתוצאה מכך, תאי iNKT הוכחו להיות מעורב מבחינה תפקודית בשיפור או פיתוח של מגוון רחב של פתולוגיות כוללים מחלת שיגרון 7 וסרטן <sup> 8. נכון לעכשיו, ligands תא iNKT הסינתטי מהווה adjuvants חיסון חדש ומבטיח שיכול להיות מסוגל ויסות מספר תנאי immunopathological.
זה בעבר כבר הוכיח כי יכולים להיות שנוצרו בתאים במבחנה iNKT הבאים בידוד מרקמת עכבר זאת; רבים מהמחקרים האלה להעסיק את השימוש של תאים ראשוניים הצגת אנטיגן (נגמ"שים) ו / או תא קווים 9, מהונדס Vα14 TCR (TG) עכברים 10, או thymomas לדור של hybridomas תאים שמקורם iNKT 11,12. יתר על כן, מספר גדול של עכברים, כמויות גדולות של חומרים כימיים כגון הדימרים טעונים αGalCer CD1d, ופעמים תרבות ארוכות לעשות כמה פרוטוקולים שפורסמו פחות מבחינה אתית וכלכלי מושך 9,13.
בדוח זה אנו מתארים שיטה מותאמת לבידוד ובהרחבת מבחנה של תאי iNKT מטחול עכבר. באופן ספציפי יותר, הפרוטוקול מתאר שיטהלהעשרת תאי iNKT מטחול עכבר אשר מפחית את העכברים, חומרים כימיים וזמן הנדרש למיון תא FACS, ומציע גישה מותאמת להרחבת תאי iNKT הטחול מיון במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעדים קריטיים בפרוטוקול הנוכחי כוללים בידוד וההעשרה הבאה של CD5 + לימפוציטים (סעיף 1 ו -2), FACS (סעיף 3) מיון וציפוי הראשוני של תאי iNKT (סעיף 4). הצעדים שבוצעו בסעיף 1, זוכר שכבה בזהירות ההשעיה סלולרית הטחול על מדיום שיפוע הצפיפות כך שביניים סלולריים שונים נוצר בעקבות צנט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
