Оптимизированная метод выделения и расширение Инвариантные естественных киллеров Т-клеток из селезенки мыши
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
Способность быстро выделять цитокины при стимуляции является функциональная характеристика инвариантной естественных киллеров Т (iNKT) клеточной линии. iNKT клетки, следовательно, характеризуется как врожденной Т клеточной популяции, способным активировать и рулевое приобретенного иммунного ответа. Развитие усовершенствованных методов культуры и расширения мышиных клеток iNKT облегчает изучение биологии iNKT клеток в в пробирке и в естественных условиях модельных систем. Здесь мы описываем оптимизированный процедуру для выделения и расширения мышиных клеток селезенки iNKT.
Селезенки из мышей C57BL / 6, удаляются, рассекали и напряженными, и полученную суспензию сотовой наслаивали на градиента плотности сред. После центрифугирования, селезенки одноядерные клетки (МНК) собирали и CD5-позитивных (CD5 +) лимфоциты обогащены с использованием магнитных шариков. iNKT клетки в фракции CD5 + впоследствии окрашивали ^5; GalCer загружены CD1d тетрамер и очищают сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). FACS-отсортированы iNKT клетки затем культивируют в первоначально пробирке с использованием комбинации рекомбинантный мышиный цитокинов и пластинчатые связан Т-клеточный рецептор (TCR) раздражители перед расширением в присутствии мышиного рекомбинантного IL-7. Используя эту технику, около 10 8 клеток iNKT могут быть получены в течение 18-20 дней культивирования, после чего они могут быть использованы для функциональных анализов в пробирке, или для экспериментов ин виво у мышей передачи.
Introduction
Мышиные инвариант естественные киллеры T (iNKT) клетки особым население врожденных Т-лимфоцитов, отобранных в тимусе по CD1d-выражения корковых тимоцитов 1,2. iNKT клетки экспрессируют Т-клеточный рецептор (TCR), состоящий из инвариантной Vα14-Jα18 TCR цепи паре либо Vβ8, Vβ7 или Vβ2 ТКР 3, который способен распознавать эндогенные, а также чужеродные антигены липидов в контексте CD1d. Например, мышиные клетки распознают iNKT и активируются эндогенного антигена липидов называемого isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, а также альфа-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, гликолипид изолированы от морских губок. TCR-зависимой активации iNKT клеток способствует грунтованию приобретенного иммунного ответа, и в результате, iNKT клетки, как было показано, функционально вовлечен в улучшение или развитие диапазоне патологий, включая ревматические болезни и рак 7 <SUP> 8. В настоящее время синтетические лиганды iNKT клеток представляют перспективные новые вакцинные адъюванты, которые могут быть способны регулировать количество иммунопатологических условиях.
Ранее было показано, что клетки iNKT могут быть получены в лабораторных следующие отрыве от мыши ткани однако; многие из этих исследований используют использование первичных антиген-представляющих клеток (АРС) и / или клеточных линий 9, Vα14 TCR трансгенной (Tg) мышей 10, или тимомы для генерации клеток, полученных гибридом iNKT 11,12. Кроме того, большое количество мышей, высокие объемы реагентов, таких как αGalCer загруженных CD1d димеров, и длительное время культивирования сделать некоторые опубликованные протоколы менее этически и экономически привлекательным 9,13.
В этом докладе мы описываем адаптированный метод для изоляции и в пробирке расширения iNKT клеток из селезенки мыши. Более конкретно, протокол описан способдля обогащения iNKT клетки от селезенки мыши, что снижает мышей, реагенты и время, необходимые для FACS сортировки клеток, а также предлагается оптимизированный подход для расширения отсортированные селезенки iNKT клетки в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в текущем протоколе включают изоляцию и последующее обогащение CD5 + лимфоцитов (раздел 1 и 2), FACS сортировки (раздел 3) и начальное обшивки iNKT клеток (раздел 4). Из шагов, выполняемых в разделе 1, не забудьте тщательно слой селезенки суспензии клеток за плотности градие…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. . BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in ‘real time’. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
