माउस तिल्ली से अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाओं को अलग करने और विस्तार के लिए एक अनुकूलित विधि
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
तेजी से उत्तेजना पर साइटोकिन्स स्रावित करने की क्षमता अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) सेल वंश के एक कार्यात्मक विशेषता है। iNKT कोशिकाओं इसलिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय करने और स्टीयरिंग अनुकूली में सक्षम एक जन्मजात टी सेल की आबादी के रूप में होती हैं। murine iNKT कोशिकाओं की संस्कृति और विस्तार के लिए बेहतर तकनीक के विकास में इन विट्रो और इन विवो मॉडल प्रणाली में iNKT कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन की सुविधा। यहाँ हम अलगाव और murine प्लीहा iNKT कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन।
C57BL / 6 चूहों से Spleens, हटाया विच्छेदित और तनावपूर्ण है और जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर निलंबन घनत्व ढाल मीडिया पर स्तरित है कर रहे हैं। Centrifugation के बाद, प्लीहा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) एकत्र कर रहे हैं और CD5 पॉजिटिव (CD5 +) लिम्फोसाइट चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने के लिए समृद्ध कर रहे हैं। CD5 + अंश के भीतर iNKT कोशिकाओं बाद ^ साथ दाग रहे हैं5; CD1d टेट्रामर GalCer-भरी हुई है और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा शुद्ध। FACS murine पुनः संयोजक आईएल 7 की उपस्थिति में विस्तार किया जा रहा से पहले पुनः संयोजक murine साइटोकिन्स और थाली बाध्य टी सेल रिसेप्टर (TCR) उत्तेजनाओं के संयोजन का उपयोग iNKT कोशिकाओं शुरू तो इन विट्रो में सुसंस्कृत हैं सुलझा लिया। लगभग 10 8 iNKT कोशिकाओं वे इन विट्रो में कार्यात्मक assays के लिए, या चूहों में इन विवो हस्तांतरण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसके बाद संस्कृति के 18-20 दिनों के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है इस तकनीक का उपयोग करना।
Introduction
Murine अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) कोशिकाओं CD1d व्यक्त कॉर्टिकल thymocytes 1,2 द्वारा थाइमस में चयनित जन्मजात टी lymphocytes की एक विशिष्ट जनसंख्या हैं। iNKT कोशिकाओं Vβ8, Vβ7 या CD1d के संदर्भ में अंतर्जात साथ ही विदेशी लिपिड एंटीजन को पहचानने में सक्षम है जो Vβ2 TCRs 3, या तो साथ रखा एक अपरिवर्तनीय Vα14-Jα18 TCR श्रृंखला के शामिल एक टी सेल रिसेप्टर (TCR) व्यक्त करते हैं। उदाहरण के लिए, murine iNKT कोशिकाओं को समझते हैं और एक अंतर्जात लिपिड प्रतिजन बुलाया isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, साथ ही α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, समुद्री स्पंज से अलग एक glycolipid द्वारा सक्रिय कर रहे हैं। TCR निर्भर <iNKT कोशिकाओं की सक्रियता अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के भड़काना को बढ़ावा देता है, और एक परिणाम के रूप में, iNKT कोशिकाओं गठिया रोग 7 और कैंसर सहित विकृतियों की एक सीमा के सुधार या विकास में कार्यात्मक रूप से शामिल होने के लिए दिखाया गया हैसमर्थन> 8। वर्तमान में, सिंथेटिक iNKT सेल ligands immunopathological स्थितियों की एक संख्या को विनियमित करने में सक्षम हो सकता है कि होनहार नया टीका adjuvants गठन।
यह पहले iNKT कोशिकाओं हालांकि माउस ऊतक से अलगाव के बाद इन विट्रो में उत्पन्न किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया है; इन अध्ययनों के कई प्राथमिक प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) और / या सेल लाइनों 9 के उपयोग के काम, Vα14 TCR ट्रांसजेनिक (टीजी) iNKT सेल व्युत्पन्न हाइब्रिडोमास 11,12 की पीढ़ी के लिए चूहों 10, या thymomas। इसके अलावा, चूहों की बड़ी संख्या है, ऐसे αGalCer से भरी हुई CD1d dimers, और लंबा संस्कृति बार के रूप में अभिकर्मकों की उच्च मात्रा कुछ प्रकाशित प्रोटोकॉल कम नैतिकता की दृष्टि से और आर्थिक रूप से 9,13 अपील करें।
इस रिपोर्ट में हम अलगाव के लिए और माउस तिल्ली से iNKT कोशिकाओं की इन विट्रो विस्तार में एक अनुकूलित विधि का वर्णन है। अधिक विशेष रूप से, प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णनFACS सेल छँटाई के लिए आवश्यक चूहों, अभिकर्मकों और समय कम कर देता है, और इन विट्रो में हल प्लीहा iNKT कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण का प्रस्ताव है जो माउस तिल्ली से iNKT कोशिकाओं को समृद्ध बनाने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम अलगाव और CD5 + लिम्फोसाइटों (धारा 1 और 2) के बाद के संवर्धन, FACS छँटाई (धारा 3) और iNKT कोशिकाओं के प्रारंभिक चढ़ाना (धारा 4) शामिल हैं। धारा 1 में प्रदर्शन कदम की, ध्यान से एक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
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