A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
ونحن لشرح طريقة فحص المخدرات جديد لتحديد تقارب ملزمة للجزيئات الدواء الصغيرة لبروتين الهدف من خلال تشكيل nanoclusters الفلورسنت الذهب (الاتحاد الافريقي البلاغات) في البروتين محملة بالمخدرات، استنادا إلى إشارة التفاضلية مضان المنبعثة من الاتحاد الافريقي البلاغات. ويتم اختيار الألبومين بروتينات مثل الألبومين البشري المصل (هائل سعيد أنعم) وألبومين المصل البقري (BSA)، والبروتينات نموذج. يتم اختبار أربعة أدوية الجزيئية الصغيرة (على سبيل المثال، ايبوبروفين، الوارفارين، الفينيتوين، وسلفانيلاميد) من الانتماءات الملزمة مختلفة لالبروتينات الزلال. وقد وجد أن معدل تشكيل الفلورسنت البلاغات الاتحاد الافريقي داخل بروتين الألبومين المخدرات تحميلها في ظل ظروف تغيير طبيعة (أي 60 درجة مئوية أو في وجود اليوريا) أبطأ من تلك التي تشكلت في البروتين البكر (بدون أدوية). وعلاوة على ذلك، تم العثور على كثافة الفلورسنت من البلاغات كما شكلت لتكون مرتبطة عكسيا مع الانتماءات الملزمة لهذه الأدوية إلى البروتينات الزلال. خصوصا،وارتفاع تقارب البروتين المخدرات ملزمة، وأبطأ معدل تكوين الاتحاد الافريقي البلاغات، وبالتالي لوحظ كثافة مضان أقل من الناتج الاتحاد الافريقي البلاغات. ولشدة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات الناتجة يوفر قدرا بسيطا من قوة ملزمة النسبية للمخدرات مختلفة اختبارها. هذا الأسلوب هو أيضا قابلة للتمديد لقياس ثابت معين من البروتين المخدرات ملزم (K D) ببساطة عن طريق تنويع المحتوى المخدرات مسبقة في البروتين في تركيز البروتين ثابت. تطابق نتائج قياس بشكل جيد مع القيم التي تم الحصول عليها باستخدام هيبة ولكن أكثر تعقيدا وسائل أخرى.
Introduction
الالبيومينات المصل مثل الألبومين البشري المصل (هائل سعيد أنعم) وألبومين المصل البقري (BSA) هي البروتين الأكثر وفرة في البلازما وتلعب دورا حيويا في الحفاظ على الضغط الاسموزي للمقصورة الدم. يتم التعرف أيضا على أنها البروتينات الحاملة لجزيئات صغيرة من انخفاض للذوبان في الماء، مثل المنشطات، والأحماض الدهنية، هرمونات الغدة الدرقية، ومجموعة متنوعة واسعة من المخدرات. خاصية الربط (على سبيل المثال، مواقع ملزمة، تقارب أو قوة ملزمة) من هذه الجزيئات إلى المصل الالبيومينات يشكل موضوعا هاما في الدوائية. وقد وضعت 1-4 عدة طرق تحليلية لدراسة خصائص ملزم من الأدوية المختلفة لالمصل الالبيومينات، مثل البلورات بالأشعة السينية، 5،6 الرنين النووي المغناطيسي (NMR)، 11/07 ومأكل سطح الرنين (SPR)، 12،13 الخ ومع ذلك، يتم تقييد هذه الطرق إما عن طريق عملية تحليل شاقة وتستغرق وقتا طويلا (على سبيل المثال، ونمو الكريستال واحد لcrystallo الأشعة السينيةدراسة الرسوم البيانية)، شرط معدات متخصصة ومكلفة (SPR)، أو في حاجة إلى وضع العلامات نظير تكلفة (NMR) للكشف. ولذلك فمن المستحسن للغاية لتطوير طرق بديلة للشركات الصغيرة الجزيئي فحص المخدرات بطريقة سريعة ومباشرة إلى الأمام، وفعالة من حيث التكلفة.
nanoclusters الذهب (الاتحاد الافريقي البلاغات) هي نوع خاص من المواد متناهية الصغر، والتي تحتوي على عدة عشرات من ذرات المعدن مع أحجام أصغر من 2 نانومتر. 14-17 وقد اجتذبت اهتمامات بحثية واسعة نظرا لبنيتها الإلكترونية المنفصلة والتي تعتمد على الحجم، 18، 19 وما شابه الجزيئية الجواذب والانبعاثات. 20-23 هذه الخصائص مواد فريدة من نوعها، ولا سيما مضان قوية، وقد وجدت تطبيقات متنوعة مثل الاستشعار عن بعد والتصوير في النظم البيولوجية. 24-32 الصغر الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات يمكن توليفها باستخدام بروتينات وظيفية، مثل الالبيومينات مصل، كقالب 33 في توليف البروتين قالب نموذجي ل الاتحاد الافريقي البلاغات، يتم تغليف كمية معينة من الأملاح الاتحاد الافريقي لأول مرة داخل البروتين وخفضت في وقت لاحق من البروتين نفسه. ويعزى القدرة الحد من البروتين لالتأسيسية الوظيفية بقايا الأحماض الأمينية (على سبيل المثال، التيروزين) التي يمكن تفعيلها عن طريق زيادة درجة الحموضة القلوية حل ل. تتكشف من بنية البروتين يعتبر خطوة حاسمة لتشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. هذا هو لأنه في البروتين تكشفت، يمكن أن يتعرض المزيد من المجموعات الوظيفية الحد إلى أملاح الاتحاد الافريقي مغلفة. البروتين تتكشف يمكن أن يتحقق عن طريق المعالجة الحرارية أو التعرض للعوامل تغيير طبيعة. مقدمة من الأدوية الجزيئية الصغيرة يمكن أن تؤثر أيضا على العملية الجارية، أي تعديل درجة الحرارة تمسخ المنتصف والمحتوى الحراري تتكشف. 34،35 تأثير كل هذه العوامل بدورها يمكن أن تنعكس من خلال حركية تشكيل الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات والتي تتجلى في كثافة مضان الناتجة الاتحاد الافريقي البلاغات 36
e_content "> هذا الفيديو يوضح طريقة فحص المخدرات عن طريق تجميع الاتحاد الافريقي البلاغات في البروتينات الزلال محملة بالمخدرات في درجة حرارة أعلى (60 ° C) أو في وجود وكلاء تغيير طبيعة (على سبيل المثال، اليوريا). كثافة مضان من الناتج الاتحاد الافريقي البلاغات هي قراءات إشارة أولا، تم تجميعها الاتحاد الافريقي البلاغات في HSA وBSA قوالب العلاج في 60 ° C أو في وجود اليوريا لاظهار كيف البروتين تتكشف (الناجمة عن المعالجة الحرارية أو denaturants) يؤثر على حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. ثانيا، وقد تم تجميع الاتحاد الافريقي البلاغات في قوالب البروتين مسبقة مع الأدوية المختلفة، ودراسة تأثير تحميل المخدرات على كثافة مضان النسبية الناتجة الاتحاد الافريقي البلاغات، والتي توفر مقياس لقوة ملزمة النسبية. وأخيرا، تم تعديل بروتوكول الفحص الاتحاد الافريقي NC-عقار لل القياس الكمي للبروتين المخدرات ثابت ملزم (K D) من خلال تغيير محتوى المخدرات مسبقة في البروتين من تركيز ثابت.Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات الهامة التي تحتاج إلى تسليط الضوء عليها في هذا الأسلوب. في بروتوكول فحص تقارب ملزم النسبي لمختلف الأدوية الجزيئية الصغيرة، خطوات 3.1.2، 3.1.3، 3.1.4 وحاسمة للحصول على نتائج جيدة تظهر اتجاه ثابت لقوة ملزمة النسبية. في هذه الخطوات، يجب أن تصرفات إضافة م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. . Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -. e. The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. . Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).
