מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
אנו מדגימים שיטת הקרנת תרופה חדשה לקביעת הזיקה המחייבת של מולקולות תרופה קטנות לחלבון מטרה על ידי יצירת nanoclusters ניאון זהב (Au NCS) בתוך החלבון טעון התרופה, המבוסס על אותות הקרינה הנפלטים על ידי ההפרש NCS Au. חלבונים כגון אלבומין אלבומין האנושי בסרום (HSA) ואלבומין בסרום השור (BSA) נבחרו כמודל החלבונים. ארבע תרופות מולקולריות קטנות (למשל, איבופרופן, קומדין, פניטואין, וsulfanilamide) של זיקות מחייבות שונות לחלבוני אלבומין נבדקות. נמצא כי השיעור של NCS Au ניאון בתוך חלבון אלבומין תרופה טעון היווצרות תנאי denaturing (כלומר, C 60 ° או בנוכחות של אוריאה) הוא איטי יותר מזה שנוצר בחלבון הטהור (ללא תרופות). יתר על כן, עוצמת הניאון של NCS בנוי כפי שנמצאה בקורלציה הפוכה לזיקות מחייבות של תרופות אלה לחלבוני אלבומין. במיוחד,גבוה יותר זיקה לתרופות חלבון מחייבת, איטי קצב היווצרות Au NCS, ובכך עוצמת הקרינה נמוכה של Au NCS התוצאה הוא ציין. עוצמת הקרינה של NCS Au התוצאה לכן מספקת מדד פשוט של הכוח המחייב היחסי של תרופות שונות שנבדקו. שיטה זו היא גם להארכה למדוד קבוע סמים חלבון מחייב הספציפי (K D) פשוט על ידי שינוי תוכן התרופה שנטען מראש בחלבון בריכוז חלבון קבוע. התוצאות שנמדדו להתאים היטב עם הערכים שהתקבלו תוך שימוש בשיטות יוקרה אבל יותר מסובכת אחרות.
Introduction
albumins סרום כגון אלבומין בסרום אדם (HSA) ואלבומין בסרום שור (BSA) הוא החלבון הנפוץ ביותר בפלזמה ולשחק תפקיד חיוני בשמירה על הלחץ האוסמוטי של תא הדם. הם גם מוכרים כחלבונים מובילים למולקולות קטנות של מסיסות במים נמוכה, כגון סטרואידים, חומצות שומן, הורמוני בלוטת התריס, ועוד מגוון רחב של תרופות. הנכס המחייב (לדוגמא, אתרי קישור, מחייב זיקה או כוח) של מולקולות אלה לסרום albumins מהווה נושא חשוב בהפרמקוקינטיקה. 1-4 שיטות אנליטיות כמה פותחו כדי ללמוד את המאפיינים המחייבים של תרופות שונות לסרום albumins, כגון קריסטלוגרפיה רנטגן, 5,6 תהודה מגנטית גרעינית (NMR), 7-11 והתהודה plasmon פני השטח (SPR), 12,13 וכו ' עם זאת, שיטות אלה מוגבלים על ידי שני תהליך ניתוח מייגע וגוזל זמן (למשל, צמיחה של גביש יחיד לcrystallo רנטגןמחקר גרפי), דרישה של ציוד מיוחד ויקר (SPR), או בצורך של תיוג היקר איזוטופ (NMR) לצורך זיהוי. לכן רצוי מאוד לפתח דרכים חלופיות להקרנת סמים מולקולרית קטנה באופן מהיר, ישר קדימה, ועלות-יעילה.
nanoclusters זהב (Au NCS) הוא סוג מיוחד של nanomaterial, שכולל מספר לעשרות אטומי מתכת בגדלים קטנים יותר מ 2 ננומטר. 14-17 הם משכו תחומי מחקר נרחבים בשל המבנה שלהם הבדיד וגודל תלוי האלקטרוני, 18, 19 וכמו-מולקולריים קליטה ופליטה. 20-23 תכונות חומרים ייחודיים כגון, בפרט הקרינה החזקה, מצאו יישומים מגוונים כגון חישה והדמיה במערכות ביולוגיות. 24-32 ניאון ultrasmall Au NCS יכול להיות מסונתז באמצעות חלבונים פונקציונליים, כגון albumins סרום, כתבנית. 33 בסינתזת חלבון-בתבניות אופיינית של NCS Au, כמות מסוימת של מלחי Au כמוסות ראשונה בתוך החלבון ומופחת לאחר מכן על ידי החלבון עצמו. יכולת הפחתה של החלבון מיוחסת למרכיב פונקציונלי שאריות חומצת אמינו (לדוגמא, טירוזין) שיכול להיות מופעלות על ידי הגדלת ה- pH הפתרון לבסיסי. התגלגלות של מבנה חלבון נחשבת כצעד קריטי להיווצרות של NCS Au. סיבה לכך הוא בחלבון מקופל, יכולות להיחשף קבוצות פונקציונליות הפחתה יותר למלחי Au במארז. חלבון התפרשותו יכול להיות מושגת על ידי טיפול בחום או חשיפה לחומרי denaturing. מבוא של תרופות מולקולריות קטנות יכול להשפיע גם על תהליך התגלגלות, כלומר שינוי טמפרטורת denaturation האמצע ואנתלפיה של התגלגלות. 34,35 ההשפעה של כל הגורמים הללו, בתורו יכולים לבוא לידי ביטוי על ידי קינטיקה ההיווצרות של ניאון Au NCS ובא לידי ביטוי ב עוצמת הקרינה של NCS Au תוצאה. 36
e_content "> וידאו זה מדגים את השיטה של הקרנת סמים על ידי סינתזת Au NCS בחלבוני אלבומין טעון תרופה בטמפרטורה גבוהה (60 מעלות צלזיוס) או בנוכחות של סוכני denaturing (למשל, אוריאה). עוצמת הקרינה של תוצאת Au NCS הוא את הודעת האות. ראשית, NCS Au מסונתז בתבניות HSA וBSA טופלו ב 60 ° C או בנוכחות של אוריאה להראות כיצד חלבון התפרשותו (הנגרם על ידי טיפול בחום או denaturants) משפיע על קינטיקה היווצרות Au NCS. שנית, NCS Au מסונתז בתבניות חלבון מראש עם תרופות שונות, והשפעת טעינת סמים בעוצמות הקרינה היחסית של התוצאה Au NCS היא למדה, המספקים מדד לכוח מחייב יחסית. לבסוף, פרוטוקול הקרנת Au NC-התרופה שונה ל מדידת כמותית של מתמיד מחייב תרופה-חלבון (K D) על ידי שינוי תוכן התרופה שנטען מראש בחלבון של ריכוז קבוע.Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר צעדים קריטיים שצריך להיות מודגשים בשיטה זו. בפרוטוקול של הקרנת הזיקה מחייבת היחסית של תרופות מולקולריות קטנות שונות, שלבי 3.1.2, 3.1.3, ו3.1.4 הם קריטיים כדי להשיג תוצאות טובות מראה מגמה עקבית לכוח המחייב ביחס. בשלבים הבאים, הפעולות של הוספת כימיקלים וציור פתרונות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. . Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -. e. The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. . Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).
