A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
We laten een nieuw geneesmiddel screening methode voor het bepalen van de bindingsaffiniteit van kleine geneesmiddelmoleculen met een doeleiwit door de vorming van fluorescerende nanoclusters goud (Au NC) in de met geneesmiddel beladen eiwitten, gebaseerd op de differentiële fluorescentiesignaal uitgestraald door de Au NC's. Albumine eiwitten zoals humaan serumalbumine (HSA) en runderserumalbumine (BSA) gekozen als model eiwitten. Vier kleine moleculaire geneesmiddelen (bijvoorbeeld ibuprofen, warfarine, fenytoïne en sulfanilamide) van verschillende bindingsaffiniteiten aan het albumine-eiwitten worden getest. Gevonden werd dat de vormingssnelheid van fluorescente Au NC binnen het geneesmiddel geladen albumine-eiwit onder denaturerende omstandigheden (dat wil zeggen 60 ° C of in aanwezigheid van ureum) is trager dan dat gevormd in het oorspronkelijke eiwit (zonder geneesmiddelen). Bovendien wordt de fluorescentie-intensiteit van de zo gevormde NC gevonden invers gecorreleerd aan de bindingsaffiniteiten van deze geneesmiddelen aan de albumine-eiwitten. Bijzonder,hoe hoger de drug-proteïne-bindingsaffiniteit, hoe langzamer de snelheid van Au NC vorming, en dus een lagere fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NC's waargenomen. De fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NCs verschaft derhalve een eenvoudige maat voor de relatieve sterkte van binding verschillende geneesmiddelen getest. Deze methode is ook uit te breiden tot het specifieke geneesmiddel-eiwitbinding constante (KD) te meten door eenvoudigweg variëren van de hoeveelheid geneesmiddel voorgeladen in het eiwit op een vaste eiwitconcentratie. De gemeten resultaten goed overeenkomen met de verkregen met behulp van andere prestige maar ingewikkelder methoden waarden.
Serum albuminen zoals menselijk serumalbumine (HSA) en runderserumalbumine (BSA) zijn de meest voorkomende eiwitten in plasma en speelt een essentiële rol bij het handhaven van de osmotische druk van het bloedcompartiment. Ze zijn ook bekend als dragereiwitten voor kleine moleculen met lage oplosbaarheid in water, zoals steroïden, vetzuren, schildklierhormonen en diverse geneesmiddelen. De bindingseigenschap (bijvoorbeeld bindingsplaatsen, bindingsaffiniteit of sterkte) van deze moleculen serum albumine een belangrijk onderwerp farmacokinetiek. 1-4 verschillende analysemethoden zijn ontwikkeld voor de studie van de bindingseigenschappen van verschillende geneesmiddelen op albuminen serum, zoals röntgenkristallografie 5,6 kernspinresonantie (NMR), 11/07 en surface plasmon resonance (SPR), 12,13 etc. Echter, deze werkwijzen beperkt door ofwel een vervelend en tijdrovend analyseproces (bijvoorbeeld groei van éénkristal röntgen- Crystallografisch onderzoek), vereiste gespecialiseerde en dure apparatuur (SPR), of behoefte aan dure isotopen (NMR) voor detectie. Het is derhalve zeer gewenst om alternatieve manieren om kleine moleculaire drugonderzoek ontwikkelen snel, straight-forward en kostenefficiënte wijze.
Nanoclusters goud (Au NC's) zijn een speciaal type nanomateriaal, waarvan enkele tot tientallen metaalatomen met afmetingen kleiner dan 2 nm. 14-17 Zij hebben uitgebreid onderzoek belangen aangetrokken bevatten vanwege hun discrete en grootte-afhankelijke elektronische structuur, 18, 19 en moleculair-achtige absorpties en emissies. 20-23 Deze unieke materiaaleigenschappen, in het bijzonder de sterke fluorescentie, hebben diverse toepassingen zoals detectie en beeldvorming in biologische systemen. 24-32 Ultrakleine fluorescent Au NC's kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van functionele eiwitten, zoals serumalbuminen, als matrijs. 33 In een typische eiwit templated synthese van Au NCs worden een zekere Au zouten eerst ingekapseld binnen het eiwit en vervolgens gereduceerd door het eiwit zelf. Het reducerende vermogen van het eiwit wordt toegeschreven aan functionele aminozuurresiduen (bijvoorbeeld tyrosine) die kunnen worden geactiveerd door verhoging van de pH van de oplossing alkalisch samenstellende. Ontvouwen van eiwitstructuur wordt beschouwd als een kritische stap voor de vorming van Au NC. Dit komt omdat in een ongevouwen eiwit kan verminderen meer functionele groepen worden blootgesteld aan de ingekapselde Au zouten. Eiwitontvouwende kan worden verkregen door warmtebehandeling of blootstelling aan denaturerende agentia. Introductie van kleine moleculaire geneesmiddelen kan ook invloed hebben op de ontplooiing, dwz het modificeren van het middelpunt denaturatietemperatuur en de enthalpie van ontvouwen. 34,35 Het effect van al deze factoren, op zijn beurt kan worden weerspiegeld door de vorming kinetiek van fluorescerende Au NC en gemanifesteerd in de fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NC. 36
e_content "> Deze video toont de werkwijze het screenen van geneesmiddelen door het synthetiseren Au NC's in met geneesmiddel beladen albumine-eiwitten bij een hogere temperatuur (60 ° C) of in de aanwezigheid van denaturerende middelen (bijvoorbeeld ureum). De fluorescentie-intensiteit van de overblijvende Au NC is het signaal uitlezing. Eerst Au NC gesynthetiseerd in HSA en BSA templates behandeld bij 60 ° C of in aanwezigheid van ureum aan hoe eiwitontvouwende (geïnduceerd door hittebehandeling of denatureringsmiddelen) beïnvloedt de vorming kinetiek van Au NC's. Ten tweede, Au NC worden gesynthetiseerd eiwit templates voorgeladen met andere geneesmiddelen en de geneesmiddelbelading effect op de relatieve fluorescentie-intensiteiten van de overblijvende Au NC bestudeerd, waarbij de mate van relatieve binding sterkte. Tenslotte wordt het au NC-drug discovery protocol gemodificeerd kwantitatieve meting van drug-proteïne-bindingsconstante (K D) door het variëren van de hoeveelheid geneesmiddel voorgeladen in het eiwit van een vaste concentratie.Er zijn verschillende kritische stappen die moeten worden benadrukt in deze werkwijze. In het protocol van het screenen van de relatieve bindingsaffiniteit van verschillende kleine moleculaire geneesmiddelen, stappen 3.1.2, 3.1.3 en 3.1.4 zijn van cruciaal belang om goede resultaten te tonen consistente trend voor de relatieve bindende kracht te verkrijgen. In deze stappen, moet het optreden van toevoeging van chemicaliën en tekenen reactieoplossingen voor meting zo snel mogelijk op de tijdspanne effect en dezelfde vol…
The authors have nothing to disclose.
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
384-well plate | Corning | ||
5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
5000 mL Eppendorf tips | |||
1000 mL Eppendorf tips | |||
100 mL Eppendorf tips | |||
1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
20 mL glass vial with screw cap | |||
4 mL glass vial with screw cap |