Un rapide et quantitative Méthode fluorimétrique pour Small Molecule dépistage du médicament protéique Ciblage
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
Nous démontrons une nouvelle méthode de criblage de médicaments pour la détermination de l'affinité de liaison de petites molécules de médicament à une protéine cible par formation d'nanoclusters fluorescentes d'or (Au CN) au sein de la protéine de médicament chargé, sur la base du signal de fluorescence différentielle émis par le Au CN. Des protéines telles que l'albumine de sérum albumine humaine (HSA) et l'albumine de sérum bovin (BSA) sont sélectionnées comme les protéines du modèle. Quatre petits médicaments moléculaires (par exemple, l'ibuprofène, la warfarine, la phénytoïne et sulfanilamides) de différentes affinités de liaison aux protéines d'albumine sont testés. Il a été constaté que le taux de formation de fluorescence Au CN à l'intérieur de la protéine d'albumine de médicament chargée dans des conditions de dénaturation (par exemple, 60 ° C ou en présence d'urée) est plus lente que celle formée dans la protéine intacte (sans médicament). En outre, l'intensité de fluorescence du CN comme formé se trouve être inversement corrélée aux affinités de liaison de ces médicaments contre les protéines d'albumine. En particulier,plus l'affinité de liaison protéine-médicament, le ralentissement de la vitesse de formation Au CN, et donc une intensité de fluorescence inférieure de la résultante Au CN est observée. L'intensité de fluorescence de la résultante Au CN fournit donc une mesure simple de la force de liaison relative des différents médicaments testés. Cette méthode est également extensible pour mesurer la constante de liaison spécifique médicament-protéine (K D) en faisant simplement varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine à une concentration en protéine déterminée. Les résultats mesurés correspondent bien avec les valeurs obtenues en utilisant d'autres méthodes de prestige, mais plus compliquées.
Introduction
Les albumines sériques telles que l'albumine de sérum humain (HSA) et l'albumine de sérum bovin (BSA) sont la protéine la plus abondante dans le plasma et jouent un rôle vital dans le maintien de la pression osmotique du compartiment sang. Ils sont également reconnus comme protéines porteuses pour les petites molécules de faible solubilité dans l'eau, tels que les stéroïdes, les acides gras, les hormones thyroïdiennes, et une grande variété de médicaments. La propriété de liaison (par exemple, les sites de liaison, d'affinité ou force de liaison) de ces molécules au sérum albumines forme un sujet important de la pharmacocinétique. 1-4 Plusieurs méthodes analytiques ont été développées pour étudier les propriétés de liaison de différents médicaments à la sérum albumine, comme cristallographie aux rayons X, 5,6 résonance magnétique nucléaire (RMN), 7-11 et la résonance plasmonique de surface (SPR), 12,13, etc. Cependant, ces méthodes sont limitées soit par un processus d'analyse fastidieux et prend du temps (par exemple, la croissance de monocristal pour cristallographique aux rayons Xétude graphique), l'exigence de l'équipement spécialisé et coûteux (SPR), ou dans le besoin de marquage isotopique coûteuse (RMN) pour la détection. Il est donc hautement souhaitable de développer des moyens alternatifs pour les petites criblage moléculaire de la drogue d'une manière rapide, straight-forward, et rentable.
Nanoclusters de l'or (Au CN) sont un type spécial de nanomatériau qui contiennent plusieurs dizaines d'atomes de métal avec des tailles inférieures à 2 nm. 14-17 Ils ont attiré de vastes intérêts de recherche en raison de leur structure électronique discrète et dépendant de la taille, 18, 19 et moléculaire, comme des absorptions et des émissions. 20-23 Ces propriétés des matériaux uniques, en particulier la fluorescence forte, ont trouvé diverses applications telles que la détection et l'imagerie dans des systèmes biologiques. 24-32 Ultrasmall fluorescent Au CN peut être synthétisé en utilisant des protéines fonctionnelles, telles que les albumines sériques, comme matrice. 33 Dans une synthèse typique de protéine sur matrice de Au CN, une certaine quantité de sels sont des Au premier encapsulé à l'intérieur de la protéine et par la suite réduite de la protéine elle-même. Le pouvoir réducteur de la protéine constituant est attribuée à des résidus d'acides aminés fonctionnels (par exemple, tyrosine) qui peuvent être activés en augmentant le pH de la solution à alcalin. Déroulement de la structure de protéine est considérée comme une étape critique pour la formation de Au CN. En effet, dans une protéine dépliée, plusieurs groupes fonctionnels réducteurs peuvent être exposés à l'UA sels encapsulés. Dépliage de la protéine peut être obtenue par traitement thermique ou exposition à des agents dénaturants. Introduction de médicaments à petites moléculaires peut également affecter le processus de déroulement, à savoir la modification de la température de dénaturation milieu et l'enthalpie de déroulement. 34,35 L'effet de tous ces facteurs, à son tour, peut être réfléchie par la cinétique de formation de fluorescente Au CN et manifesté dans l'intensité de fluorescence des résultantes Au CN. 36
e_content "> Cette vidéo montre le procédé de criblage de médicaments par synthèse Au CN en protéines d'albumine médicament chargé à une température élevée (60 ° C) ou en présence d'agents dénaturants (par exemple urée). L'intensité de fluorescence de la résultante Au CN est la lecture du signal. Tout d'abord, Au-CN sont synthétisés dans HSA et BSA modèles traités à 60 ° C ou en présence d'urée pour montrer comment la protéine dépliage (induite par un traitement thermique ou dénaturants) affecte la cinétique de formation de Au CN. Deuxièmement, Au CN sont synthétisés dans les modèles de protéines préchargés avec différents médicaments, et l'effet de chargement de médicament sur les intensités relatives de fluorescence de résultante Au CN est étudié, qui fournissent la mesure de la force relative de liaison. Enfin, le protocole de dépistage Au NC-médicament est modifiée pour la mesure quantitative de protéine-médicament constante de liaison (K D) en faisant varier la teneur en médicament préchargée dans la protéine d'une concentration fixe.Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya plusieurs étapes critiques qui doivent être mis en évidence dans cette méthode. Dans le protocole de criblage de l'affinité de liaison relative des différents médicaments à petites moléculaires, les étapes 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 et sont essentiels pour obtenir de bons résultats montrant tendance constante pour la force relative de liaison. Dans ces étapes, les actions de l'ajout de produits chimiques et de l'élaboration de solutions de réaction pour la mesure doivent être aussi rapidement q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
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