Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
Nós demonstramos um novo método de rastreio de fármacos para a determinação da afinidade de ligação de pequenas moléculas de droga a uma proteína-alvo através da formação de nanopartículas de ouro (Au fluorescentes CN) dentro da proteína carregadas com fármaco, com base no sinal diferencial fluorescência emitida pela UA CN. Proteínas, tais como albumina de soro de albumina humana (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são seleccionados como as proteínas modelo. Quatro pequenas drogas moleculares (por exemplo, ibuprofeno, a varfarina, fenitoína, e sulfanilamida) de diferentes afinidades de ligação para as proteínas de albumina são testados. Verificou-se que a taxa de formação de Au CNs fluorescentes no interior do fármaco carregado proteína albumina sob condições desnaturantes (por exemplo, 60 ° C ou na presença de ureia) é mais lento do que se formou na proteína primitiva (sem droga). Além disso, a intensidade de fluorescência do SAE-formado como se encontra a ser inversamente correlacionadas com as afinidades de ligação destas drogas para as proteínas de albumina. Particularmente,quanto maior a afinidade da proteína de ligação de drogas, mais lenta é a taxa de formação de Au CNs, e, assim, uma intensidade de fluorescência menor do Au CNs resultante é observado. A intensidade de fluorescência das resultantes Au CNs, por conseguinte, fornece uma medida simples da força de ligação relativa de diferentes fármacos testados. Este método também é extensível para medir a constante de ligação específica à proteína droga (K D) variando simplesmente o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína a uma concentração fixa de proteína. Os resultados medidos correspondem bem com os valores obtidos usando outros métodos de prestígio mas mais complicados.
Introduction
Albuminas do soro tais como albumina do soro humano (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são a proteína mais abundante no plasma e desempenham um papel fundamental na manutenção da pressão osmótica do compartimento de sangue. Eles também são reconhecidos como proteínas veículo para moléculas pequenas de baixa solubilidade em água, tais como esteróides, ácidos gordos, hormonas da tiróide, e uma vasta variedade de drogas. A propriedade de ligação (por exemplo, locais de ligação, a afinidade de ligação ou a resistência) dessas moléculas de soro de albuminas forma um tópico importante na farmacocinética. 1-4 vários métodos analíticos foram desenvolvidos para estudar as propriedades de ligação de drogas diferentes para as albuminas do soro, tal como cristalografia de raios-X, 5,6 ressonância magnética nuclear (RMN), 7-11 e de ressonância de plasmon de superfície (SPR), 12,13 etc. No entanto, estes métodos estão limitados por qualquer um processo de análise tediosa e consumidora de tempo (por exemplo, crescimento de cristal único para Crystallo de raios-Xestudo gráfico), a exigência de equipamento especializado e caro (SPR), ou em necessidade de marcação isotópica dispendioso (RMN) para a detecção. Por conseguinte, é altamente desejável desenvolver formas alternativas de pequena seleção da droga molecular de uma maneira rápida, simples e direta, e custo-eficiente.
Nanopartículas de ouro (Au NCs) são um tipo especial de nanomaterial, que contêm várias dezenas de átomos de metal com tamanhos inferiores a 2 nm. 14-17 Eles têm atraído interesses de investigação extensas, devido à sua estrutura eletrônica discreta e dependentes de tamanho, 18, 19 e molecular como absorções e emissões. 20-23 Tais propriedades de materiais exclusivos, em particular a forte fluorescência, foram encontradas diversas aplicações, tais como detecção e visualização em sistemas biológicos. 24-32 ultrasmall fluorescente Au NCs pode ser sintetizado usando proteínas funcionais, tais como albuminas do soro, como molde. 33 Numa síntese típica da modelada por proteínas Au CNs, uma certa quantidade de sais de Au são encapsulados no interior da primeira proteína e subsequentemente reduzido pela própria proteína. A capacidade de reduzir a proteína é atribuída a constitutivos funcionais resíduos de aminoácidos (por exemplo, tirosina) que podem ser activados pelo aumento do pH da solução para alcalino. Desdobramento da estrutura da proteína é considerada como um passo crítico para a formação de Au NCs. Isto porque, em uma proteína desdobrada, os grupos funcionais mais redutores podem ser expostas a A UA sais encapsulados. Proteína se desdobrar pode ser alcançada por tratamento com calor ou a exposição a agentes desnaturantes. Introdução de pequenas drogas moleculares também pode afetar o processo de desdobramento, ou seja, modificação da temperatura de desnaturação do ponto médio e a entalpia de desdobramento. 34,35 O efeito de todos esses fatores, por sua vez, pode ser refletido pela cinética de formação de fluorescente Au NCs e manifestado em a intensidade de fluorescência resultantes Au NCs. 36
e_content "> Este vídeo demonstra o método de rastreio de fármacos através da síntese de Au CN de proteínas de albumina carregadas com fármaco a uma temperatura mais elevada (60 ° C) ou na presença de agentes desnaturantes (por exemplo, ureia). A intensidade da fluorescência resultante Au CNs é a leitura do sinal. Em primeiro lugar, Au CNs são sintetizados em moldes HSA e BSA tratadas a 60 ° C ou na presença de ureia para mostrar como a proteína se desdobrar (induzida por tratamento térmico ou desnaturantes) afecta a cinética de formação de Au NCs. Em segundo lugar, Au CNs são sintetizados em moldes de proteína pré-carregadas com drogas diferentes, e o efeito de carga da droga sobre as intensidades de fluorescência relativas dos resultante Au CNs é estudada, que fornece a medida da força de ligação relativa. Finalmente, o protocolo de rastreio Au NC-droga é modificada para medição quantitativa de proteína-droga constante de ligação (K D) variando o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína de uma concentração fixa.Protocol
Representative Results
Discussion
Há vários passos críticos que precisam ser destacadas neste método. No protocolo de rastreio da afinidade de ligação relativa das diferentes drogas moleculares pequenos, Passos 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e são críticas para se obter bons resultados que mostram tendência consistente para a força de ligação relativa. Nestas etapas, as acções de adição de produtos químicos e de desenho soluções de reacção para a medição devem ser tão rapidamente quanto possível para minimizar o efeito de atraso no tempo e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
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