En hurtig og kvantitativ Fluorimetrisk Metode til Protein-Targeting småmolekyle Drug Screening
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
Vi demonstrerer et nyt lægemiddel screeningsmetode til bestemmelse af bindingsaffiniteten af små lægemiddelmolekyler til et målprotein ved at danne fluorescerende guld nanoclusters (Au NCS) i medikamentfyldt protein, baseret på forskellen fluorescens udsendt med Au nationale kontrolsystem. Albumin proteiner, såsom humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) er valgt som model proteiner. Fire små molekylære lægemidler (f.eks, ibuprofen, warfarin, phenytoin og sulfanilamid) med forskellige bindingsaffiniteter til albuminproteiner testes. Det konstateredes, at dannelseshastigheden af fluorescerende Au NCs inde i lastet stof albumin protein under denaturerende betingelser (dvs. 60 ° C eller i tilstedeværelse af urea) er langsommere end den, der er dannet i den uberørte protein (uden medicin). Desuden er fluorescensintensiteten af som dannede NCs sig at være omvendt korreleret til bindingsaffiniteterne af disse lægemidler til albuminproteiner. Isærjo højere den lægemiddel-protein bindingsaffinitet, jo langsommere hastigheden af Au NCs dannelse, og er således observeret en lavere fluorescensintensitet af den resulterende Au nationale kontrolsystem. Fluorescensintensiteten af de resulterende Au NCs tilvejebringer derfor et simpelt mål for den relative bindingsstyrke af forskellige testede lægemidler. Denne metode er også forlænges til at måle specifikke lægemiddel-proteinbinding konstant (K D) ved blot at variere indholdet stof indlæst i proteinet ved en fast koncentration protein. De målte resultater passer godt med de værdier, der opnås ved hjælp af andre prestige men mere komplicerede metoder.
Introduction
Serumalbuminer, såsom humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) er den mest rigelige protein i plasma og spiller en afgørende rolle i at opretholde det osmotiske tryk i blodet rum. De er også anerkendt som bærerproteiner for små molekyler med lav vandopløselighed, såsom steroider, fedtsyrer, skjoldbruskkirtelhormoner, og en lang række lægemidler. Bindingen egenskab (f.eks bindingssteder, bindingsaffinitet eller styrke) af disse molekyler til serumalbuminer danner et vigtigt emne i farmakokinetik. Der er blevet udviklet 1-4 Adskillige analysemetoder til at studere bindingsegenskaberne af forskellige lægemidler til serum albuminer, såsom røntgenkrystallografi, 5,6 kernemagnetisk resonans (NMR), 7-11 og overfladeplasmonresonans (SPR), 12,13 mm Imidlertid er disse metoder begrænset af enten en kedelig og tidskrævende proces analyse (f.eks væksten af enkeltkrystal for X-ray Crystallografisk undersøgelse), kravet om specialiseret og dyrt udstyr (SPR), eller har behov for kostbar isotop mærkning (NMR) til detektion. Det er derfor meget ønskeligt at udvikle alternative metoder til små molekylære lægemiddelscreening på en hurtig, straight-forward og omkostningseffektiv måde.
Guld nanoclusters (Au NCS) er en særlig type nanomateriale, som indeholder flere til snesevis af metal atomer med størrelser mindre end 2 nm. 14-17 De har tiltrukket omfattende forskning interesser på grund af deres diskrete og størrelse afhængig elektroniske struktur, 18, 19 og molekylær-lignende absorptioner og emissioner. 20-23 Sådanne unikke materialer egenskaber, især den stærke fluorescens, har fundet forskellige applikationer såsom registrering og billeddannelse i biologiske systemer. 24-32 ultrasmå fluorescerende Au nationale koordinatorer kan syntetiseres ved hjælp af funktionelle proteiner, såsom serumalbuminer, som template. 33 I en typisk protein-template syntese af Au NCS er en vis mængde Au-salte første indkapslet inde i proteinet og efterfølgende reduceres med selve proteinet. Den reducerende evne af proteinet tilskrives bestanddel funktionelle aminosyrerester (f.eks tyrosin), der kan aktiveres ved at øge opløsningens pH til alkalisk. Udfoldning af proteinstruktur betragtes som et afgørende skridt for dannelsen af Au nationale koordinatorer. Dette skyldes, at i en udfoldet protein, kan flere reducerende funktionelle grupper udsættes for de indkapslede Au-salte. Proteinudfoldning kan opnås ved varmebehandling eller udsættelse for denatureringsmidler. Indførelse af små molekylære medicin kan også påvirke udfoldelsen processen, dvs. modificering midtpunktet denatureringstemperatur og enthalpi udfoldelse. 34,35 Virkningen af alle disse faktorer, til gengæld kan afspejles ved dannelse kinetik fluorescerende Au nationale koordinatorer og manifesteret i fluorescensintensiteten af de resulterende Au NCs. 36
e_content "> Denne video viser fremgangsmåden til lægemiddelscreening ved syntese Au NCs i læqemiddelladede albuminproteiner ved en højere temperatur (60 ° C) eller i nærvær af denatureringsmidler (fx urinstof). fluorescensintensitet resulterende Au NCs er det signal udlæsning. Først Au NCs syntetiseret i HSA og BSA skabeloner behandlet ved 60 ° C eller i nærværelse af urinstof at vise, hvordan proteinudfoldning (induceret ved varmebehandling eller denatureringsmidler) påvirker dannelsen kinetik Au NCs. For det andet, Au NCs syntetiseres i protein skabeloner indlæst med forskellige lægemidler, og lægemiddelfyldning effekt på de relative intensiteter af de resulterende Au NCS undersøgt, hvilket giver et mål for relative bindingsstyrke. Endelig er Au NC-lægemiddel-screening protokol modificeret til kvantitativ måling af lægemiddel-proteinbinding konstant (K D) ved at variere lægemiddelindhold indlæst i proteinet af en fast koncentration.Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere kritiske trin, der skal fremhæves i denne metode. I protokollen for screening af den relative bindingsaffinitet af forskellige små molekylære lægemidler, trin 3.1.2, 3.1.3 og 3.1.4 er kritiske for at opnå gode resultater, der viser konsekvent tendens for den relative binding styrke. I disse trin, bør handlinger tilføje kemikalier og tegning reaktion løsninger til måling så hurtigt som muligt være at minimere timelag-effekt, og den samme sekvens af at tilføje kemikalier og tegning reaktionsopløs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. . Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -. e. The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. . Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).
