En rask og kvantitativ fluorimetrisk Metode for Protein-Targeting lite molekyl narkotikaundersøkelser
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
Vi viser en ny medikamentscreeningmetode for å bestemme bindingsaffiniteten av små medikamentmolekyler til et målprotein ved å danne fluorescerende gull (Au nanoclusters NCS) i medikamentbelastede protein, basert på differensial fluorescens-signalet som sendes ut av Au sokkelen. Albumin proteiner, slik som humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) blir valgt som modellproteiner. Fire små molekylære medikamenter (for eksempel, ibuprofen, warfarin, fenytoin, og sulfanilamid) av forskjellige bindingsaffiniteter til albumin-proteinene er testet. Det ble funnet at dannelseshastigheten av fluorescerende Au NCs inne i stoffet som er lagt albumin proteinet under denaturerende betingelser (dvs. 60 ° C eller i nærvær av urea) er langsommere enn det som dannes i den uberørte protein (uten medikamenter). Videre er den fluorescerende intensitet av as-dannede NCs funnet å være inverst korrelert til bindingsaffinitetene av disse legemidlene til albumin proteiner. Spesieltjo høyere medikament-proteinbinding affinitet, jo langsommere hastighet på Au NCs formasjon, og således en lavere fluorescensintensitet av den resulterende Au norsk sokkel observert. Fluorescensintensiteten av de resulterende Au NCs derfor gir et enkelt mål på den relative bindingsstyrken av forskjellige medikamenter testet. Denne metoden er også utvides til å måle den spesifikke medikament-proteinbindingskonstant (K D) ved ganske enkelt å variere medikamentinnhold er forhåndslagret i protein ved en fast proteinkonsentrasjon. De målte resultatene samsvarer godt med verdiene oppnådd ved hjelp av andre prestisje, men mer kompliserte metoder.
Introduction
Serumalbuminer, slik som humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) er de mest tallrike protein i plasma, og spiller en viktig rolle i å opprettholde det osmotiske trykk på blodrommet. De er også anerkjent som bærerproteiner for små molekyler med lav vannløselighet, slik som steroider, fettsyrer, skjoldbruskkjertelhormoner, og et bredt spekter av medikamenter. Bindingen egenskap (f.eks bindingsseter, bindingsaffinitet eller styrke) av disse molekylene for å serumalbuminer utgjør et viktig tema i farmakokinetikk. 1-4 Flere analytiske metoder har blitt utviklet for å studere bindingsegenskapene til forskjellige medikamenter for å serumalbuminer, såsom røntgenkrystallografi, 5,6 kjernemagnetisk resonans (NMR), 7-11 og overflate-plasmonresonans (SPR), 12,13 etc. Imidlertid er disse fremgangsmåter begrenset av enten en omstendelig og tidkrevende prosess analyse (for eksempel, vekst av enkeltkrystall for X-ray krystallografiskegrafisk undersøkelse), krav om spesialisert og kostbart utstyr (SPR), eller som har behov for kostbare isotop merking (NMR) for deteksjon. Det er derfor sterkt ønskelig å utvikle alternative måter for små molekylære narkotika screening på en rask, rett fram, og kostnadseffektiv måte.
Gull (Au nanoclusters NCS) er en spesiell type nanomaterialer som inneholder flere titalls metallatomer med størrelser mindre enn 2 nm. 14-17 De har tiltrukket omfattende forskning interesser på grunn av deres størrelse og diskret avhengige elektroniske struktur, 18, 19 og molekylær-lignende absorptions og utslipp. 20-23 Slike unike materialegenskaper, spesielt sterk fluorescens, har funnet diverse applikasjoner som sensing og bildebehandling i biologiske systemer. 24-32 ultra fluorescerende Au NCs kan syntetiseres ved hjelp av funksjonelle proteiner, slik som serumalbuminer, som templat. 33 I en typisk protein malbasert syntese av Au sokkelen blir en viss mengde av Au-salter første innkapslet inne i proteinet, og deretter redusert med proteinet i seg selv. Den reduserende evne av protein tilskrives konstituerende funksjonelle aminosyrerester (f.eks, tyrosin) som kan aktiveres ved å øke oppløsningens pH til alkalisk. Utfoldelsen av proteinstruktur anses som et avgjørende skritt for dannelsen av Au norsk sokkel. Dette skyldes at i utfoldet protein, kan flere reduserende funksjonelle grupper bli utsatt for de innkapslede Au-salter. Protein utfolding kan oppnås ved varmebehandling eller eksponering for denaturerende midler. Innføring av små molekylære medikamenter kan også påvirke utbrettingsprosessen, det vil si å modifisere punktet denatureringstemperaturen og entalpien av utfoldelsen. 34,35 Effekten av alle disse faktorene, kan igjen bli reflektert av de formasjonskinetikken av fluorescerende Au norsk sokkel og manifestert i fluorescens intensitet resulterende Au norsk sokkel. 36
e_content "> Denne videoen demonstrerer metoden for legemiddelscreening ved å syntetisere Au norsk sokkel stoffbelastede albumin-proteiner ved en høyere temperatur (60 ° C), eller i nærvær av denatureringsmidler (for eksempel urea). Fluorescensintensiteten av resulterende Au NCs er signalet avlesning. Først blir Au NCs syntetisert på HSA og BSA-maler ble behandlet ved 60 ° C, eller i nærvær av urea for å vise hvordan protein utfolding (indusert ved varmebehandling eller denatureringsmidler) påvirker dannelsen kinetikken for Au sokkelen. For det andre, Au norsk sokkel syntetisert protein maler forhåndslastet med ulike legemidler, og den medikament-last virkning på de relative fluorescensstyrkene resulterende Au norsk sokkel studert, som gir et mål på relativ bindingsstyrke. Til slutt blir den Au NC-drug screening protokoll modifisert for kvantitativ måling av medikament-proteinbindingskonstant (K D) ved å variere medikamentinnhold er forhåndslagret i proteinet av en fastsatt konsentrasjon.Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere viktige skritt som må fremhevet i denne metoden. I protokollen for screening den relative bindingsaffinitet av forskjellige små molekylære stoffer, trinnene 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 og er avgjørende for å oppnå gode resultater viser gående tendens for den relative binding styrke. I disse trinnene, bør handlingene til tilsette kjemikalier og tegning reaksjons løsninger for måling være så raskt som mulig for å minimere tidsforsinkelsen effekt og samme sekvens av tilsette kjemikalier og tegning reaksjo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. . Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -. e. The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. . Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).
