실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
효율적인 면역 반응은 감염이나 부상의 사이트에 혈액 백혈구의 신속한 동원에 의존한다. 생체 내에서 백혈구의 이동을 조사하는 혈관 내피 세포와 백혈구의 transendothelial 마이그레이션 및 상호 작용의 분자 기초를 이해하는 데 매우 중요합니다. 하나의 강력한 접근 방식은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다.
여기에서 우리는 거꾸로 공 초점 현미경 오렌지 염료 표지 호중구 주입 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스 IV에 영상 단핵구와 호중구을위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 영화는 모두 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 혈관에서 백혈구 행동의 분석을 허용 영상의 몇 시간이 30 분에서 모였다. 로컬 TLR2 / TLR1 효능 Pam3SK4과 혈관 염증을 유발하고 subseque을 모니터에 우리는 또한 단계를 설명호중구와 단핵구의 NT 모집.
제시된 기법은 또한 백혈구의 다른 개체군을 모니터링하고 다른 자극 또는 트랜스 제닉 마우스를 이용하여 백혈구 보충 또는 거래에 관련 분자를 조사하는데 사용될 수있다.
Introduction
호중구와 단핵구는 지속적으로 혈액 순환 선천성 면역 체계의 세포이다. 부상이나 감염되면 염증 신호는 여기에 세포 면역 반응 1-3 시작, 손상 및 감염 조직으로 백혈구 diapedesis를 유도한다. 백혈구 동원의 신속성은 면역 반응의 긍정적 인 결과를 결정한다. 이러한 복잡한 프로세스는 백혈구에 연루 분자에 대한 통찰력을 얻을 .TO 순환 백혈구와 내피 1-3 사이의 접착제 접촉의 설립을 도와 염증이 내피 세포에 존재하는 특정 분자 (예를 들어, 셀렉틴, 내피 세포 결합 된 케모카인)에 의존 모집 캐스케이드, 그것은 세포의 모집 동력학을 시각화하고, 각 셀 / 인구의 동작을 추적하는 것이 중요하다. 효과적인 방법은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다.
현재까지 콘텐츠 ">, 생체 내에 현미경을 사용하여 여러 가지 방식은 화상에 개발 된 맥관 4,5-. 예를 들어, 귀 진피 혈관 또는 생체 내에 공 촛점 현미경으로 장간막 정맥 촬상 뮤린 Ly6C 낮은 단핵구 및 인간의 순찰 동작을 식별하는 데 사용 하였다 CD14는 정상 상태 조건 6-8 하에서 혈관의 내강 측에 CD16 + 단핵구 희미. 마우스 cremaster의 혈관 모델은 종종 트랜스 제닉 마우스에서의 염증 또는 허혈 조건 호중구 염증 Ly6C 높은 단구의 동작을 모니터링하기 위해 사용된다. 것을 경우, cremaster이 IL1β, CCL2, TNFβ 또는 fMLP의 intrascrotal 주입을 통해 자극한다. 2-4 시간 후, 조직은 수술 표면화되고, 생체 내에 공 초점 현미경 9-11으로 분석 하였다.다음은 프로토콜과 동시에 단핵구 및 호중구를 모니터링하는 방법을 설명거꾸로 형광 공 초점 현미경. 또한, 우리의 방법은 백혈구 모집의 역학을 수행하는 방법에 대해 이전 이미지 같은 용기 (정상 상태)과 염증 후에 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 목적을 위해, 우리는 누구의 단핵구 eGFP는 표현, IV 오렌지 염료 표지 쥐의 호중구 주입 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스를 사용합니다. 반전 된 공 초점 현미경을 사용하여, (1) 추적하고 정상 상태 조건 및 (2) 로컬 염증 후 동일한 용기에서 두 단핵구 및 호중구의 채용을 따르지하에 순찰 Ly6C 낮은 단핵구를 분석 할 수있다. 여기에서 우리는 TLR2 / TLR1 효능 Pam3CSK4 (12)를 사용하여 염증 상태를 만듭니다. 또한, 이러한 영상은 특정 녹아웃 마우스 또는 차단 항체 6,9,13의 존재 하에서 수행하는 경우 백혈구 모집 캐스케이드의 다양한 단계에 대한 관심의 특정 분자의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서 설명하는 방법을 효율적으로 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 정맥에서 단핵구와 호중구의 행동을 연구하는 일관성있는 접근 방식을 제공한다.
준비의 중요한 단계는 PBS-젖은 조직과 소장의 고정입니다. 제대로 수행 한 경우, 장간막 혈관 멋지게 이미지 수집에 대한 커버 슬립에 노출되어있다. 이는 장간막 혈관에서 백혈구의 동작을 모니터링하는 관심 여러 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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