Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Efficiënte immuunrespons afhangt van snelle mobilisatie bloed leukocyten naar de plaats van infectie of letsel. Onderzoeken leukocytenmigratie in vivo is cruciaal voor het begrijpen van de moleculaire basis van de migratie van leukocyten en interactie met vasculaire endothelium. Een krachtige aanpak omvat opklaren op transgene muizen die fluorescerende eiwitten in de cellen van belang.
Hier presenteren we een protocol voor imaging monocyten en neutrofielen in de CX 3 CR1 GFP / wt muis iv geïnjecteerd met oranje kleurstof gelabelde neutrofielen met een omgekeerde confocale microscoop. Time-lapse films verzameld van 30 min tot enkele uren beeldvorming kan de analyse van leukocyten gedrag mesenterische aderen onder zowel statische en ontstekingsaandoeningen. We beschrijven ook de stappen om lokaal opwekken bloedvat ontsteking met TLR2 / TLR1 agonist Pam3SK4 en bewaken van de subsequent rekrutering van neutrofielen en monocyten.
De gepresenteerde techniek kan ook worden gebruikt om andere populaties van leukocyten controleren en onderzoeken moleculen betrokken bij leukocyt rekrutering handel of op andere stimuli of transgene muizen.
Introduction
Neutrofielen en monocyten zijn cellen van het aangeboren immuunsysteem die continu circuleren in het bloed. Bij verwonding of infectie, inflammatoire signalen veroorzaken leukocyten diapedesis in beschadigde en geïnfecteerde weefsels, hierin het initiëren van een cellulaire immuunrespons 1-3. De snelheid van leukocyten mobilisatie bepaalt de positieve uitkomst van de immuunrespons. Deze ingewikkelde processen zich op specifieke moleculen (bv selectines, endotheel-gebonden chemokinen) aanwezig op het ontstoken endotheel waarmee de instelling van hechtmiddel contacten tussen circulerende leukocyten en het endotheel 1-3 .Om inzichten over de moleculen betrokken bij het leukocyt krijgen recruitment cascade, is het belangrijk om de kinetiek van celrecrutering visualiseren en het gedrag van elke cel / populatie volgen. Een effectieve methode houdt intravitale microscopie op transgene muizen die fluorescerende eiwitten in cellen van belang.
content "> Tot op heden verschillende manieren gebruikt intravitale microscopie ontwikkeld om beeld het vaatstelsel 4,5. Bijvoorbeeld, beeldvorming van het oor dermis vasculatuur of mesenterische aderen door intravitale confocale microscopie werd gebruikt om het gedrag van muizen patrouilleren Ly6C lage monocyten en menselijke identificeren CD14 dim CD16 + monocyten aan de luminale zijde van bloedvaten onder stabiele omstandigheden 6-8. De muis cremaster vasculatuur model wordt vaak gebruikt om het gedrag van neutrofielen of inflammatoire Ly6C hoge monocyten onder ontstekings- of ischemische aandoeningen in transgene muizen te volgen. In dat geval wordt cremaster gestimuleerd via scrotum injectie van IL1β, CCL2, TNFP of fMLP. Na 2-4 uur, weefsels worden vervolgens chirurgisch exteriorized en intravitale confocale microscopie 11/09 geanalyseerd.Het volgende protocol beschrijft een werkwijze voor monocyten en neutrofielen tegelijk met elke monitoromgekeerde fluorescentie confocale microscoop. Verder Home onze methode hoe het hetzelfde schip vóór (steady state conditie) en na ontsteking en hoe de kinetiek van leukocyten werving volgen. Hiervoor maken we gebruik van de CX 3 CR1 GFP / wt muis, wiens monocyten uiten eGFP, iv geïnjecteerd met een oranje kleurstof gelabelde muizen neutrofielen. Met behulp van een omgekeerde confocale microscoop, is het mogelijk (1) op te sporen en te analyseren het patrouilleren Ly6C laag monocyten onder stabiele omstandigheden en (2) voor de aanwerving van zowel monocyten en neutrofielen in hetzelfde vat na lokale ontsteking te volgen. Hier maken we de inflammatoire aandoeningen met behulp van de TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12. Bovendien kunnen dergelijke beeldvorming bijdragen tot de rol van specifieke moleculen van interesse in de verschillende stappen van de rekrutering van leukocyten cascade bepalen of uitgevoerd op bepaalde knock-out muizen of in aanwezigheid van blokkerende antilichamen 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit manuscript beschreven methoden zorgen voor een consistente aanpak om efficiënt studeren monocyten en neutrofielen gedrag in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire aandoeningen.
De cruciale stap van het preparaat is de immobilisatie van de darm met PBS bevochtigde weefsels. Als dit goed wordt uitgevoerd, worden mesenteriale vaten mooi bloot op het dekglaasje voor het overname. Dit maakt de selectie van verscheidene gebieden van belang leukocyten gedrag mesenterische ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
