Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Risposta immunitaria efficace dipende da una rapida mobilitazione dei leucociti del sangue al sito di infezione o lesioni. Indagare la migrazione dei leucociti in vivo è di fondamentale importanza per la comprensione delle basi molecolari della migrazione dei leucociti transendoteliale e l'interazione con l'endotelio vascolare. Un approccio potente coinvolge microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule di interesse.
Qui vi presentiamo un protocollo per i monociti imaging e neutrofili nel CX 3 CR1 GFP / peso del mouse iv iniettato con arancio neutrofili dye-etichettati con un microscopio confocale invertito. Film time-lapse raccolti da 30 minuti a diverse ore dell'imaging permettere l'analisi del comportamento dei leucociti nelle vene mesenteriche sia in condizioni di stato e infiammatorie costante. Abbiamo inoltre descritti i passi per indurre localmente infiammazione dei vasi sanguigni con TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 e monitorare la subsequent reclutamento dei neutrofili e monociti.
La tecnica presentata può anche essere utilizzato per monitorare altre popolazioni di leucociti e indagare le molecole implicate nel reclutamento dei leucociti o nel traffico con altri stimoli o topi transgenici.
Introduction
Neutrofili e monociti sono cellule del sistema immune innato che circolano continuamente nel sangue. Su lesioni o infezioni, segnali infiammatori inducono leucociti diapedesi in tessuti danneggiati e infetti, qui l'avvio di una risposta immunitaria cellulare 1-3. La rapidità di leucociti mobilizzazione determina l'esito positivo delle risposte immunitarie. Questi processi intricati basano su molecole specifiche (ad esempio, selectine, chemochine endotelio-bound) presenti sull'endotelio infiammata che aiutano per la creazione di contatti tra adesivi leucociti circolanti e l'endotelio 1-3 .Per ottenere approfondimenti sulle molecole implicate nella leucociti assunzione in cascata, è importante visualizzare la cinetica di reclutamento di cellule e per monitorare il comportamento di ciascuna cella / popolazione. Un metodo efficace consiste microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule di interesse.
content "> Ad oggi, diversi approcci usando la microscopia intravitale sono stati sviluppati per l'immagine del sistema vascolare 4,5. Ad esempio, l'imaging del derma orecchio vascolarizzazione o vene mesenteriche mediante microscopia confocale intravitale è stato utilizzato per identificare il comportamento pattugliamento delle Ly6C murino monociti bassi e umano CD14 dim CD16 + monociti sul lato luminale dei vasi sanguigni a regime di 6-8. Il modello di vascolarizzazione del mouse cremastere viene spesso utilizzato per monitorare il comportamento di neutrofili o Ly6C infiammatoria elevati monociti in condizioni infiammatorie o ischemiche in topi transgenici. In tale caso, Cremaster è stimolata mediante iniezione intrascrotale di IL1β, CCL2, TNFβ o fMLP. Dopo 2-4 ore, i tessuti vengono poi chirurgicamente esteriorizzate e analizzati da confocale microscopio intravitale 9-11.Il protocollo seguente descrive un metodo per monitorare monociti e neutrofili contemporaneamente con qualsiasifluorescenza invertito microscopio confocale. Inoltre, il nostro metodo descrive come immagine stessa nave prima (condizione di stato stazionario) e dopo l'infiammazione e come seguire la cinetica di reclutamento dei leucociti. A questo scopo, si usa il CX 3 CR1 topo GFP / peso, il cui monociti esprimere eGFP, iv iniettato con un arancio neutrofili murini dye-etichettati. Utilizzando un microscopio confocale invertito, è possibile (1) per monitorare e analizzare le pattugliamento Ly6C basse monociti in condizioni stazionarie e (2) a seguire l'assunzione di entrambi i monociti e neutrofili nella stessa nave dopo infiammazione locale. Qui creiamo le condizioni infiammatorie utilizzando l'agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Inoltre, tali immagini può aiutare a determinare il ruolo di specifiche molecole di interesse nelle varie fasi della cascata reclutamento dei leucociti se eseguita su specifici topi knock-out o in presenza di anticorpi bloccanti 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le metodologie descritte in questo manoscritto forniscono un approccio coerente per studiare in modo efficiente monociti e il comportamento dei neutrofili nelle vene mesenteriche in condizioni di stato e infiammatorie costante.
La fase cruciale della preparazione è l'immobilizzazione dell'intestino con tessuti PBS-bagnate. Se eseguita correttamente, vasi mesenterici sono ben esposti sul vetrino per l'acquisizione delle immagini. Ciò consente la selezione di vari campi di intere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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