Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Effiziente Immunantwort ist abhängig schnelle Mobilisierung von Blut Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Untersuchung Leukozytenmigration in vivo ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Basis der Leukozyten transendotheliale Migration und Interaktion mit Gefäßendothel. Ein leistungsfähiger Ansatz beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine in Zellen von Interesse.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Bildgebung Monozyten und Neutrophilen im CX 3 CR1 gfp / wt-Maus iv mit orangefarbenen Farbstoff markierten Neutrophilen mit einem invertierten konfokalen Mikroskop injiziert. Zeitraffer-Filme gesammelt von 30 Minuten bis zu mehreren Stunden der Bildgebung ermöglicht die Analyse von Leukozyten-Verhalten in Mesenterialvenen unter beiden stationären und entzündlichen Erkrankungen. Wir beschreiben auch die Schritte, um vor Ort zu induzieren Entzündung der Blutgefäße mit TLR2 / TLR1 Agonist Pam3SK4 und Überwachung der subsequent Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten.
Die vorgestellte Technik kann auch verwendet werden, um andere Populationen von Leukozyten zu überwachen und zu untersuchen, Moleküle mit anderen Reizen oder transgenen Mäusen in Leukozytenrekrutierung oder Menschenhandel in Verbindung gebracht werden.
Introduction
Neutrophilen und Monozyten sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die kontinuierlich im Blut zirkulieren. Nach Verletzung oder Infektion, Entzündungssignale induzieren Leukozyten-Diapedese in beschädigte und infizierten Geweben, die hierin Initiieren eine zelluläre Immunantwort 1-3. Die Schnelligkeit der Mobilisierung von Leukozyten bestimmt das positive Ergebnis der Immunantworten. Diese komplizierte Prozesse stützen sich auf spezifische Moleküle (zB Selectine, Endothel-gebundenen Chemokine) auf der entzündeten Endothel vorhanden, die für die Einrichtung von Klebe Kontakte zwischen zirkulierenden Leukozyten und dem Endothel 1-3 .Um Erkenntnisse über die Moleküle in der Leukozyten beteiligt Hilfe bekommen Einstellungskaskade ist es wichtig, um die Kinetik der Zellrekrutierung zu visualisieren und das Verhalten der einzelnen Zelle / Population verfolgen. Eine wirksame Methode beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine in Zellen von Interesse.
Inhalt "> Bis heute wurden mehrere Ansätze mit Intravitalmikroskopie, um Bild entwickelt das Gefäßsystem 4,5. So wurde beispielsweise bildgebende Ohr Dermis Gefäßsystem oder Mesenterialvenen von Intravital konfokale Mikroskopie verwendet, um das Verhalten der Mäuse-Patrouillen Ly6C niedrigen Monozyten und menschliche identifizieren CD14 dim CD16 + Monozyten auf der luminalen Seite der Blutgefäße unter stationären Bedingungen 6-8. Die Maus Cremaster Gefäßmodell wird häufig verwendet, um das Verhalten von Neutrophilen oder entzündlichen Ly6C Hoch Monozyten unter entzündlichen oder ischämischen Bedingungen in transgenen Mäusen zu überwachen. In der Fall wird Cremaster über intrascrotal Injektion von IL1β, CCL2, TNFß oder fMLP stimuliert. Nach 2-4 Stunden, Gewebe werden dann chirurgisch nach außen verlagert und durch Intravitalmikroskopie 9-11 analysiert konfokalen.Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Monozyten und Neutrophile gleichzeitig mit jedem Monitorinvertierten Fluoreszenz konfokalen Mikroskop. Außerdem Details unserer Methode zur Darstellung von demselben Schiff vor (Beharrungszustand) und nach Entzündungen und wie man die Kinetik der Rekrutierung von Leukozyten zu folgen. Zu diesem Zweck verwenden wir die CX 3 CR1 gfp / wt-Maus, deren Monozyten exprimieren eGFP, IV mit einem orangen Farbstoff-markierten Maus-Neutrophilen injiziert. Unter Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop ist es möglich, (1) zu verfolgen und zu analysieren, die Patrouillen Ly6C niedrigen Monozyten unter stationären Bedingungen und (2), um die Einstellung beider Monozyten und Neutrophilen im gleichen Gefäß nach dem lokale Entzündung zu folgen. Hier schaffen wir die entzündlichen Erkrankungen mit Hilfe der TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 12. Darüber hinaus können solche Bildern dienen, die die Rolle von spezifischen Molekülen von Interesse in den verschiedenen Schritten der Leukozytenrekrutierung Kaskade bestimmen, ob auf bestimmten Knock-out-Mäusen oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpern 6,9,13 geführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in dieser Handschrift beschriebenen Methoden bieten einen konsistenten Ansatz für Monozyten und Neutrophilen Verhalten effizient studieren in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Erkrankungen.
Der entscheidende Schritt der Herstellung ist die Immobilisierung des Darms mit PBS-befeuchtete Tücher. Wenn sie richtig durchgeführt wird, werden Mesenterialgefäße schön auf dem Deckglas für die Bildaufnahme ausgesetzt ist. Dies ermöglicht die Auswahl von mehreren Bereich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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