Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Etkin bağışıklık tepkisi enfeksiyon veya hasar bölgesinde kan lökositlerinin hızla harekete bağlıdır. In vivo lökosit göçü incelenmesi damar endotel ile lökosit endotel göç ve etkileşim moleküler temelini anlamak için çok önemlidir. Bir etkili bir yaklaşım ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir.
Burada bir ters konfokal mikroskop ile turuncu boya etiketli nötrofil enjekte CX 3 CR1 GFP / ağırlık fare iv görüntüleme monosit ve nötrofillerin için bir protokol mevcut. Time-lapse film hem kararlı hal ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde lökosit davranışının analizine imkan görüntüleme birkaç saat 30 dk toplandı. Yerel TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 kan damarı inflamasyonunu indüklemek ve subseque izlemek Ayrıca adımları açıklarnötrofil ve monositlerin nt işe.
Sunulan teknik aynı zamanda lökositlerin diğer popülasyonları izlemek ve diğer uyaranlara veya transgenik fareler kullanılarak lökosit alımı veya insan ticareti karışmış molekülleri araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Nötrofiller ve monositler sürekli dolaşıma doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücreleri bulunmaktadır. Yaralanma ya da enfeksiyon üzerine, enflamatuar sinyaller burada hücresel bir bağışıklık tepkisi başlatılması 1-3, hasar görmüş enfekte dokulara lökosit ROS neden olur. Lökosit seferberlik hızlılığı bağışıklık tepkilerinin olumlu sonucunu belirler. Bu karmaşık süreçler lökosit karışmış moleküller üzerinde anlayışlar elde .To dolaşan lökositler ve endotelyum 1-3 arasındaki yapışma temasların kurulması için yardım iltihaplı endotel üzerinde bulunan belirli moleküllerin (örneğin, selektinler, endotel bağlı kemokinler) güveniyor işe alım çağlayan, hücre işe kinetiği görselleştirmek için ve her bir hücre / nüfus davranışlarını izlemek için önemlidir. Etkili bir yöntem ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir.
Bugüne kadar içeriği ">, intravital mikroskopi kullanılarak çeşitli yaklaşımlar görüntüye geliştirilen damar 4,5. Mesela, kulak dermis damar sistemi ya da intravital konfokal mikroskobu ile mezenterik damarların görüntüleme kemirgen Ly6C düşük monosit ve insan devriye davranışını tanımlamak için kullanılan CD14 kararlı hal şartları altında 6-8 kan damarlarının lümen tarafında CD16 + monositleri dim. Fare cremaster damar modeli, genellikle transgenik farelerin enflamatuvar veya iskemik koşullar altında nötrofil veya enflamatuar Ly6C yüksek monosit davranışını izlemek için kullanılır. Bu ise durumda, Cremaster IL1β, CCL2, TNFβ ya fMLP intraskrotal enjeksiyon ile uyarılır. 2-4 saat sonra, dokular daha sonra cerrahi dışarı çıkarılmıştır ve intravital konfokal mikroskopi 9-11 ile analiz edilmiştir.Aşağıdaki protokol bir ile aynı anda monositleri ve nötrofilleri izlemek için bir yöntemi tarif etmektedirters floresan konfokal mikroskop. Ayrıca, yöntem lökosit işe kinetiği takip nasıl daha önce görüntü aynı geminin (kararlı hal durumu) ve inflamasyon sonra nasıl ayrıntıları. Bu amaç için, olan monositler eGFP ifade iv portakal renkli bir boya etiketli kemirgen nötrofillerinin, enjekte CX 3 CR1 gfp / ağ fare kullanılır. Ters konfokal mikroskop kullanılarak, (1) izler ve kararlı koşullar ve (2) lokal enflamasyon sonrasında aynı kap içinde iki monosit ve nötrofillerin ilerlemesini takip etmek altında devriye Ly6C düşük monositleri analiz etmek mümkündür. Burada TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 kullanarak inflamatuar koşullar yaratır. Ayrıca, bu tür görüntüleme belirli nakavt fareler üzerinde ya da engelleme antikorların 6,9,13 varlığında gerçekleştirilir ise lökosit işe çağlayan çeşitli adımlar ilgi belirli moleküllerin rolünü belirlemek için yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda anlatılan metodolojiler verimli kararlı durum ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde monosit ve nötrofil davranışlarını incelemek için tutarlı bir yaklaşım sağlamak.
Hazırlık önemli adım PBS ıslak mendil ile bağırsak immobilizasyonu olduğunu. Düzgün gerçekleştirilen Eğer mezenterik damarlar güzel görüntü elde etmek için lamel maruz kalmaktadır. Bu mezenterik venlerde lökosit davranışını izlemek için ilgi çeşitli alanlarda seçimini sa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
