Imaging Neutrofiler og monocytter i mesenterisk Veins av intraMikros på bedøvet Mus i sanntid
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Effektiv immunresponsen er avhengig av rask mobilisering av blodleukocytter til stedet for infeksjon eller skade. Gransker leukocyttmigrasjon in vivo er avgjørende for å forstå den molekylære grunnlaget for leukocytter transendothelial migrasjon og samhandling med vaskulær endotel. En kraftig tilnærming innebærer intramikroskopi på transgene mus som uttrykker fluorescerende proteiner i celler av interesse.
Her presenterer vi en protokoll for bildebehandling monocytter og nøytrofile i CX 3 CR1 GFP / wt mus iv injisert med oransje fargemerkede nøytrofile med en invertert konfokal mikroskop. Time-lapse filmer samlet fra 30 min til flere timer med bildebehandling tillate analyse av leukocytter atferd i tarmens blodårer under begge stabile og betennelsestilstander. Vi beskriver også fremgangsmåten for å lokalt indusere blodåre betennelse med TLR2 / TLR1 agonist Pam3SK4 og overvåke subsequent rekruttering av nøytrofile granulocytter og monocytter.
Den presenterte teknikken kan også brukes til å overvåke andre populasjoner av leukocytter og undersøke molekyler involvert i leukocytt rekruttering eller trafficking ved hjelp av andre stimuli eller transgene mus.
Introduction
Nøytrofiler og monocytter er celler i det medfødte immunsystem som kontinuerlig sirkulerer i blodet. Ved skade eller infeksjon, betennelsessignaler indusere leucocyte diapedese inn skadet og infisert vev, heri initiere en cellulær immunrespons 1-3. Hurtighet av leukocytter mobilisering bestemmer positive utfallet av immunresponser. Disse intrikate prosesser er avhengige av spesifikke molekyler (f.eks selectins, endotel-bundet chemokiner) til stede på den betente endotelet som bidrar til etablering av selvklebende kontakter mellom sirkulerende leukocytter og endotelet 1-3 .For få innsikt i molekylene innblandet i leukocytter rekruttering kaskade, er det viktig å visualisere de kinetikken til celle rekruttering og å spore oppførselen til hver celle / populasjon. En effektiv metode omfatter intravital mikroskopi på transgene mus som uttrykker fluorescerende proteiner i celler av interesse.
innhold "> Til dags dato, ble flere tilnærminger som bruker intramikroskopi utviklet til bilde blodkar 4,5. For eksempel ble avbildning av øret dermis blodkar eller mesenteriets vener av intra konfokalmikroskopi brukes til å identifisere patruljering oppførselen murine Ly6C lave monocytter og menneskelig CD14 dim CD16 + monocytter på den luminale siden av blodårer under stabile betingelser 6-8. Musen cremaster vaskulaturen modell blir ofte brukt til å overvåke virkemåten av nøytrofiler eller inflammatorisk Ly6C høye monocytter henhold inflammatoriske eller ischemiske tilstander i transgene mus. I denne tilfellet er cremaster stimuleres via intrascrotal injeksjon av IL1β, CCL2, TNFå eller fMLP. Etter 2-4 timer, vev blir deretter kirurgisk exteriorized og analysert av intra konfokalmikroskopi 9-11.Følgende protokoll beskriver en metode for å overvåke monocytter og nøytrofiler på samme tid med en hvilken som helstinvertert fluorescens konfokalmikroskop. Videre detaljer vår metode hvordan bildet det samme fartøyet før (steady state tilstand) og etter betennelse og hvordan de skal følge kinetikken av leukocytt rekruttering. Til dette formålet bruker vi CX 3 CR1 GFP / wt mus, hvis monocytter uttrykke EGFP, iv injisert med en oransje fargemerkede murine nøytrofile. Ved hjelp av en invertert konfokalmikroskop, er det mulig (1) for å spore og analysere patruljer Ly6C lave monocytter under stabile tilstandsbetingelser, og (2) for å følge rekruttering av både monocytter og nøytrofile i samme beholder etter lokal betennelse. Her skaper vi de betennelsestilstander ved hjelp av TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12. Videre kan en slik avbildning med på å bestemme rollen til spesifikke molekyler av interesse i de forskjellige trinnene av leukocytt-rekruttering kaskade hvis utført på bestemte knock-out-mus, eller i nærvær av blokkerende antistoffer 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som er beskrevet i dette manuskriptet gi en konsistent tilnærming til effektivt studere monocytt- og nøytrofile atferd i tarmens blodårer under stabile og betennelsestilstander.
Det avgjørende skritt av preparatet er immobiliseringen av tarmen med PBS-fuktede vev. Hvis det utføres riktig, blir mesenteriske fartøy pent eksponert på dekkglass for bildeopptak. Dette gjør at utvalget av flere felt av interesse å overvåke leukocytt atferd i tarmens blodårer.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
