Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Effektiv immunsvaret är beroende av en snabb mobilisering av blodleukocyter till platsen av infektion eller skada. Undersöka leukocytmigration in vivo är avgörande för att förstå den molekylära grunden för leukocyter transendotelial migration och interaktion med kärlendotelet. En kraftfull metod innebär intravital mikroskopi på transgena möss som uttrycker fluorescerande proteiner i celler av intresse.
Här presenterar vi ett protokoll för avbildning monocyter och neutrofiler i CX 3 CR1 gfp / vikt mus iv injiceras med orange färgämnesmärkta neutrofiler med ett inverterat konfokalmikroskop. Time-lapse filmer som samlats in från 30 minuter till flera timmar av imaging tillåter analys av leukocyt beteende mesenteriska ådror under både stationära och inflammatoriska tillstånd. Vi beskriver också stegen att lokalt framkalla inflammation i blodkärlen med TLR2 / TLR1 agonist Pam3SK4 och övervaka subsequent rekrytering av neutrofiler och monocyter.
De presenterade tekniken kan också användas för att övervaka andra populationer av leukocyter och undersöka molekyler inblandade i leukocytrekrytering eller handel med hjälp av andra stimuli eller transgena möss.
Introduction
Neutrofiler och monocyter är celler av det medfödda immunförsvaret som kontinuerligt cirkulerar i blodet. Vid skada eller infektion, inflammatoriska signaler inducerar leukocyt diapedes i skadade och infekterade vävnader, häri initiera ett cellulärt immunsvar 1-3. Den snabba leukocyter mobilisering bestämmer det positiva resultatet av de immunsvar. Dessa intrikata processer är beroende av specifika molekyler (t.ex. selektiner, endotel bundna kemokiner) som finns på den inflammerade endotel som hjälper för att fastställa självhäftande kontakter mellan cirkulerande leukocyter och endotel 1-3 .För få insikter om molekylerna inblandade i leukocyter rekrytering kaskad, är det viktigt att visualisera kinetiken hos cellrekrytering och för att spåra beteendet hos varje cell / populationen. En effektiv metod innebär intravital mikroskopi på transgena möss som uttrycker fluorescerande proteiner i celler av intresse.
innehåll "> Hittills har flera metoder med hjälp av intravital mikroskopi utvecklats för att avbilda kärl 4,5. Till exempel var avbildning av öron dermis kärl eller mesenteriska vener genom intravital konfokalmikroskopi används för att identifiera patruller beteende mus Ly6C låga monocyter och mänsklig CD14 dim CD16 + monocyter på luminala sidan av blodkärl under stationära betingelser 6-8. Musen cremaster kärlmodellen används ofta för att övervaka beteendet hos neutrofiler eller inflammatorisk Ly6C höga monocyter enligt inflammatoriska eller ischemiska tillstånd i transgena möss. I detta fall cremaster stimuleras via intrascrotal injektion av IL1β, CCL2, TNFP eller fMLP. Efter 2-4 h, vävnader sedan kirurgiskt exteriorized och analyserades med intravital konfokalmikroskopi 9-11.Följande protokoll beskriver en metod för att övervaka monocyter och neutrofiler samtidigt med någoninverterat fluorescens konfokalmikroskop. Dessutom, vår metod beskriver hur bilden samma fartyg före (stabilt tillstånd) och efter inflammation och hur man följer kinetik leukocytrekrytering. För detta ändamål använder vi CX 3 CR1 gfp / vikt mus, vars monocyter uttrycker EGFP, iv injiceras med en orange färgämnesmärkta murina neutrofiler. Med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop, är det möjligt (1) för att spåra och analysera patrullera Ly6C låga monocyter under stationära betingelser och (2) att följa rekryteringen av både monocyter och neutrofiler i samma kärl efter lokal inflammation. Här skapar vi inflammatoriska tillstånd med hjälp av TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12. Dessutom kan en sådan avbildning hjälpa till att avgöra vilken roll specifika molekyler av intresse i de olika stegen i leukocytrekrytering kaskad om det utförs på specifika knock-out-möss eller i närvaro av blockerande antikroppar 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som beskrivs i detta manuskript ger en konsekvent strategi för att effektivt studera monocyt och neutrofil beteende mesenteriska ådror under stationära tillstånd och inflammatoriska tillstånd.
Det avgörande steget i beredningen är immobiliseringen av tarmen med PBS-vätta vävnader. Om det utförs på rätt sätt, är mesenteriska fartyg snyggt exponerad på täck för bildtagning. Detta möjliggör val av flera intresseområden för att övervaka leukocyt beteenden i mesen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
