Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

Published: February 29, 2016 doi: 10.3791/53617
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1,3, 1
1Yale Cardiovascular Research Center, Internal Medicine, Yale University, 2Department of Medicine, University of California, San Diego, 3APHP Groupe Hospitalier Pitié-Salpètrière, Université Pierre and Marie Curie
* These authors contributed equally

Summary

Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra.

Introduction

As células estaminais neurais de mamífero (NCCC) foram caracterizados in vitro pela sua capacidade para crescer em culturas de livre flutuação como aglomerados de células neuroesferas 1 denominadas dividindo. Na presença de factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), NSC dividir quer simetricamente para gerar NSC auto-renovação, ou assimetricamente para gerar duas células filhas diferentes, ie., Uma célula progenitora de diferenciação e um romance NSC. Culturas de neuroesferas são, portanto, uma mistura de células estaminais / progenitoras neuronais e células neurais diferenciadas mais 2-4 NSC pode, contudo, ser distinguido de outros tipos de células de neuroesferas por duas propriedades específicas:. Eles exibem a longo prazo de auto-renovação em LIVRE culturas flutuante e que podem se diferenciar em todas as linhagens de células neurais (isto é, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos e seguintes) retirada de factores de crescimento e adesão a substratos de matriz extracelulares. em mammALS, o sistema de cultura de neuroesferas foi o primeiro sistema in vitro utilizado para demonstrar a presença de NSC no cérebro adulto e mantém-se o instrumento mais vulgarmente utilizado para analisar a proliferação, capacidade de auto-renovação e multipotência de células estaminais e progenitoras neurais. Portanto, embora os ensaios de formação de esfera sofrem de algumas desvantagens e limitações 4, este sistema de cultura é valiosa para a avaliação do potencial de uma célula a comportar-se como uma célula estaminal quando removido do seu nicho in vivo 4 e tem contribuído para identificar reguladores chaves de NSC de auto-renovação e destino celular determinação 5-7.

Em contraste com os mamíferos que a neurogênese adulta limitados, peixe-zebra constitutivamente produzir novos neurônios ao longo de todo o eixo cérebro durante toda a sua vida. O cérebro de peixe zebra adulto exibe vários nichos neurogênicos abrigar células estaminais neuronais / progenitoras que fazem zebrafish um modelo poderoso organismo para a compreensão tEle stem a actividade de células no cérebro, bem como os programas molecular necessários para a regeneração do sistema nervoso central. Ao longo dos últimos 17 anos, vários grupos de pesquisa desenvolvida metodologias para o isolamento e cultura de células neurais zebrafish 8,9. Esses estudos tiveram como objetivo produzir neuronal embrionário e células gliais in vitro, mas não a manutenção NSCs e investigar suas propriedades. Embora neuroesferas foram gerados no adulto Apteronotus leptorhynchus (Brown fantasma knifefish) 10, um ensaio de formação de neuroesfera no peixe-zebra manteve-se a ser estabelecida.

Descrevemos aqui um ensaio de formação de neuroesfera para demonstrar o papel de miR-107 durante 11 neurogénese peixe-zebra. O protocolo permite que: 1) a coleta de células-tronco / progenitoras neurais adultas quer a partir do cérebro inteiro peixe-zebra ou de várias regiões cerebrais dissecados como o telencéfalo, a tectum, eo cerebelo; 2) a produção de FLflutuante e neurospheres auto-renovação das células-tronco / progenitoras neurais adultas; 3) a jusante e a sobre-regulação da expressão de genes que codificam ou pequenos RNAs não-codificantes nas neuroesferas 11, a fim de investigar o seu papel na proliferação e diferenciação de células estaminais / progenitoras neurais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Peixe-zebra da estirpe WT CF foram criados e mantidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê da Universidade Yale Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC número de protocolo 2012-11473). Todos os experimentos deve primeiro ser aprovado por todos ética governamentais e institucionais relevantes órgãos reguladores em relação ao uso de animais para fins de investigação.

1. Preparações

  1. Preparar 10 ml de meio de dissecção, adicionar 200 ul de 100x penicilina-estreptomicina em 9,8 ml de DMEM / F12.
  2. Preparar solução de L-cisteína: a 10 ml de água para cultura de tecidos, adicionar 120 mg de L-cisteína. Guardar a solução de L-cisteína a 4 ° C durante até 2 semanas, ou em alíquotas a -20 ° C durante até 1 ano.
  3. Preparar solução de ADNase I: a 1 ml de água para cultura de tecidos, adicionam-se 10 mg de ADNase I. loja a solução de ADNase I a 4 ° C durante até 2 meses.
  4. Preparar solução de papaína: a preparar papaína solutião, adiciona-se 100 ul de papaina (cerca de 140 unidades), 100 ul de DNase I (1%) e 200 ul de L-cisteina (12 mg / ml) em 5 ml de DMEM / F12. Recentemente preparar a solução de papaína de cada vez e esterilizar com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização.
  5. Preparar a solução de lavagem: para preparar 100 ml de solução de lavagem, adicionar 650 ul de glucose 45%, 500 mL de HEPES 1 M e 5 ml de FBS em 93,85 ml de DPBS 1x. Esterilizar a solução de lavagem com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização. Guardar a solução de lavagem a 4 ° C durante até 2 meses.
  6. Preparar a solução de insulina: para preparar a 2 ml de solução de insulina, adicionar uma gota de 25 ul de NaOH 10 N e 100 mg de insulina em 2 ml de água para cultura de tecidos.
  7. Preparar soluções de EGF e FGF: Dissolve-se ambos os agentes mitogénicos em meio DMEM / F12 a 100 ug / ml de concentração. Loja como alíquotas de 10 uL a -20 ° C.
  8. Prepare meios B-27 e N-2: B-27 e N-2 suplementos armazenar a -20 ° C, tal como 500 ul de aliquotas de 1 mL e, respectivEly.
  9. Prepare forma condição de Z-diferenciação: para preparar 100 ml de meio condicionado Z-diferenciação, adicionar 40 uL de insulina (50 mg / ml), 500 ul de B-27, 1 ml de N-2, 650 ul de glucose 45% e 1 ml de 100 x penicilina-estreptomicina em 97,81 ml de DMEM / F12. Esteriliza-se o meio condicionado Z-diferenciação com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização. Armazenar a forma condição de Z-diferenciação a 4 ° C durante até 1 semana.
  10. Prepare a forma de Z-condição: para preparar 50 ml de meio de Z-condição, adicionar 10 ul de EGF e 10 ul de FGF-se em 50 ml de meio condicionado-Z diferenciação estéril (20 ng / ml). Armazenar a forma de Z-condição a 4 ° C durante até 1 semana.
  11. Preparar a solução de revestimento para a cultura de diferenciação: por 5 ml de solução de revestimento extracelular, adicionar 100 ul da solução de matriz extracelular em 4,9 ml de DMEM / F12 (por exemplo, Matrigel.). solução de matriz extracelular Descongelar a 4 ° C em gelo. Uma vez descongelado, manter a 4 ° C para up a 2 semanas.

2. Dissecção do cérebro adulto Zebrafish

  1. Prepare uma dissecção cama, preenchendo um 100 milímetros x 15 mm placa de Petri com pacotes de gelo gel. Em seguida, colocar a tampa no prato de petri e incubar à temperatura de -20 ° C até o congelamento de gel. No topo do lugar da tampa de um quadrado de papel de filtro limpo e envolva tanto o papel de filtro e placa de Petri com filme plástico.
  2. Limpar e esterilizar todos os instrumentos de microdissecção por 70% de etanol ou de calor antes de cada utilização. Coloque todos os instrumentos de dissecção esterilizados perto do microscópio de dissecação e, logo antes da eutanásia, colocar a cama dissecção sob o microscópio com iluminação de fibra óptica.
  3. Recolha 2 peixe-zebra adulto para uma preparação neurosphere cérebro inteiro; e 3 a 4 para gerar peixes-zebra a partir de neuroesferas regiões cerebrais dissecados.
  4. Eutanásia peixe-zebra adulto (8-12 meses de idade) usando um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal. Em seguida, mergulhe o peixe em 75% de etanol durante 5-10 segundos e rapidamente colocar na cama dissecção seguido por decapitação ao nível das brânquias utilizando uma lâmina cirúrgica.
    1. A eutanásia animais, administrar uma dose excessiva (300 mg / L) de metano-sulfonato tricaina até do animal batida de coração desacelera gradualmente para baixo e a circulação pára, em seguida, mergulhar em água gelada.
  5. Vire o lado da cabeça dorsal para baixo, e usando a tesoura fazer um corte longitudinal do lado do corte na boca. Usando fórceps expor a base do crânio e remover todo o tecido adjacente. Corte as paredes laterais do crânio a partir do início da medula espinal para o tectum.
  6. Usando a tesoura, cortar e remover os nervos ópticos e, em seguida, remover ambos os lados da parte mais lateral do crânio no nível do tectum. Vire a cabeça ventral para cima. Utilizando uma pinça, retire o resto da parte mais apical do crânio.
  7. Transferir o cérebro, juntamente com a parte restante do crânio para um novo prato with o meio dissecção (1,1). Limpar o tecido cerebral, a médio dissecção usando cabo de plástico no micro da faca, mantendo todas as estruturas do cérebro intacto.
  8. A partir deste ponto, continuar o protocolo utilizando todo o cérebro de peixe zebra.
    1. Alternativamente adaptar este protocolo para regiões específicas do cérebro para gerar neurospheres de toda cérebro de peixe zebra ou do telencéfalo, tectum / diencephalon ou cerebelo dissecados com um bisturi fresco. Use uma linha fluorescente específica neural peixe-zebra transgénicos neural para dissecar a região do cérebro de interesse de acordo com a Figura 3 e referência 11.

3. A dissociação de células individuais de cérebro adulto

  1. Executar todo o trabalho subsequente em uma cabine de segurança biológica. Transferir o tecido cerebral em um tubo de 1,5 mL contendo 800 uL de meio de dissecção (preparado no passo 1.1). Remover o meio de dissecção por pipetagem, sem tocar no tecido cerebral.
  2. Adicionar 500 ul de solução de papaína (passo 1.4) e digerir o tecido do cérebro a 37 ° C durante 10 min. Não incubar mais de 15 min, uma vez que pode diminuir a viabilidade celular.
  3. Após a incubação, a transferência do tecido cerebral com 500 ul da solução de papaína em um tubo de 15 ml usando um 1000 ul corte na ponta da pipeta ~ 0,25 polegadas a partir do fundo. Gentilmente dissociar o tecido cerebral lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes com a mesma ponta. Não pipetar para cima e para baixo mais de 15 vezes e não gerar bolhas de ar durante esta etapa, uma vez que poderia alterar a viabilidade celular.
  4. Incubar o tecido cerebral de novo a 37 ° C durante 10 min, seguido por pipetagem para cima e para baixo 10-13 vezes utilizando um sem cortes 1.000 ul ponta regular. Não pipetar cima e para baixo mais de 15 vezes, para evitar a morte celular.
  5. Parar a digestão enzimática por adição de 2 ml de solução de lavagem (passo 1.5), e centrifuga-se a suspensão de células a 800 xg durante 5 min à temperatura ambiente (TA). Decantar cuidadosamente as supernatant e ressuspender o sedimento na solução remanescente batendo o tubo vigorosamente com um dedo e, em seguida, pipetando para cima e para baixo com um 1.000 ul ponta regular. Em seguida, adicionar 2 ml de solução de lavagem.
  6. Nesta fase, verificar ao microscópio, que foi obtida uma suspensão de células individuais. Centrifugar novamente a suspensão de células a 800 xg durante 5 min à TA. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet utilizando 1 mL de meio de Z-condição fresca (passo 1.10).
  7. Células mancha usando azul de tripano 12 e contar as células vivas usando um hemocitômetro por exclusão de células mortas azuis. Prepara-se uma placa de 24 poços com 200 ul de suspensão de células e 300 ul de meio-Z condição fresca em cada poço. Semear as células a uma densidade de ~ 500 células / mL. Manter as células em cultura numa incubadora a 30 ° C em 5% de CO 2, uma vez que neuroesferas derivadas do cérebro de peixe-zebra não crescem bem a 37 ° C.

4. Geração de Primary neuroesferas </ P>

  1. Após 1 dia in vitro (Div1), observar a suspensão de células individuais obtidas a partir de todo o cérebro adulto sob o microscópio e observar se os detritos se acumulou no centro do poço. Cuidadosamente remover quaisquer detritos por pipetagem de aproximadamente 100 ul de meio (menos, se possível). Em seguida, adicione 100 ml de meio de Z-condição fresco. As suspensões de células individuais deve ser observado neste momento (Figura 2A Div1).
  2. Após 2 dias in vitro (Div2), expandir-se as células em cultura. Usando uma pipeta de 1000 uL com o corte da ponta, recolher e transferir 250 ul de suspensão de células de cada poço para um poço novo. Adicionar 250 mL de meio Z-condição fresco em todos os poços. Antes de expandir as células cultivadas, homogeneizar a suspensão muito suavemente pipetando cima e para baixo durante todo o bem.
  3. Repita os passos 4.1 e 4.2 para os seguintes 4 dias in vitro (DiV4). Um aumento progressivo do tamanho do neurospheres deve ser visível no centro e nas extremidades do poço a Div3 e DiV4 (Figura 2B e C).
    Nota: neurospheres primárias podem ser processados ​​para a passagem ou diferenciação para avaliar multipotency. Alternativamente, eles podem ser processados ​​para nucleofection ou lipo-transfecção de 11 a caracterizar o papel de genes específicos durante o processo de diferenciação.

5. Passaging da Primária neuroesferas

  1. Retirar 250 ul de cultura de tecidos de cada poço e mecanicamente dissociar DiV4 neuroesferas com uma pipeta de 1 ml. Não pipetar cima e para baixo muito rapidamente como a formação de bolhas de ar podem aumento da morte celular.
  2. Contar as células com um hemocitómetro e distribuir 800 células / uL em 250 uL de sobrenadante de cultura primária em cada poço de uma placa de 24 poços.
  3. Adicionar 250 ul de meio de Z-condição para cada poço.
  4. Após 2 dias in vitro (Div2), expandir-se as células em cultura como relatado no passo 4.2 umad 4.3.

6. Diferenciação de neuroesferas primária

  1. Esterilizar vidros de cobertura por imersão em etanol a 70% durante 10 min, vidros de cobertura, em seguida, seco à temperatura ambiente, colocando-os em cada poço de uma placa de 12 poços.
  2. Adicionar 300 ul de solução de revestimento extracelular (passo 1.11) no centro da tampa de vidro, de tal maneira que possa expandir amplamente e abrange todo o vidro de cobertura. Em seguida, incuba-se a 37 ° C durante 1 h (utilizando a cultura de células incubadora humidi ficada).
  3. Remover a solução de revestimento extracelular após a incubação, e seca-se a tampa de vidro durante 2 horas a 37 ° C.
  4. Retirar 250 ul de cultura de tecido a partir de cada poço. Mecanicamente dissociar todos os DiV4 neurospheres primários por poço com uma pipeta de 1 ml (com ponta mais larga-end) por pipetagem cima e para baixo.
  5. Semente dissociado suspensões de células de neuroesferas com uma densidade celular de 4 x 10 células / 3 mL em esfregaços revestidos de matriz extracelulares previamente preparados (passo 6,1-6.3) e manter durante pelo menos 30 min, a 30 ° C em 5% de CO2, até ligada ao substrato. Em seguida, remover o meio de cultura e adiciona-se rapidamente 1 ml de meio fresco condição de Z-diferenciação de pré-aquecido (passo 1.9), antes da cultura das células durante 24 h a 30 ° C em 5% de CO 2.
  6. De dois em dois dias, substituir metade do meio condição de Z-diferenciação durante o tempo de diferenciação celular.

7. Gene Manipulação de Primary neuroesferas

  1. Recolhe DiV3-4 neuroesferas primárias (Passo 4.3) por centrifugação durante 8 min a 80 x g a 4 ° C. Prepare-se para transfecção de lipossomas de oligonucleoatides comerciais como previouly descrito 11 ou nucleo-transfecção de vectores de plasmídeo de DNA.
  2. Ressuspender o granulado neuroesfera a uma densidade celular de 4 x 10 3 células / uL em 100 uL de uma mistura reaccional (solução nucleofactor 82 ul e 18 ul de complemento).
  3. Misture a suspensi neuroesferacom 5 ul de plasmídeo de ADN dos vectores de escolha (stocks de plasmídeo a 1 ug / uL). Transferir a mistura neuroesfera / ADN numa cuvete para Nucleofector nucleotransfection e seleccionar Nucleofector programa de acordo com as instruções do fabricante fornecidas pelo kit Nucleofector.
  4. Imediatamente após nucleofection, adicionar um volume de 500 ml de meio de Z-condição pré-aquecido (1,10) às células e as neuroesferas placa transfectadas para estudar a sua renovação celular e / ou propriedades de diferenciação, tal como descrito acima.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Esquema geral da Neurosphere Cultura Zebrafish Adulto

Descrevemos aqui todos os passos do protocolo de um ensaio de formação de neuroesfera realizada a partir do cérebro de peixe zebra adultos. Primeiro, as células estaminais / progenitoras neuronais adultas foram recolhidos quer a partir de cérebro inteiro de peixe-zebra ou a partir de várias regiões do cérebro tais como o dissecados telencéfalo, tectum e o cerebelo (Figuras 1A-C). Suspensão única célula de células estaminais / progenitoras neurais adultas foram então utilizados para gerar flutuante e neurospheres auto-renovação (Figuras 1D, E). Finalmente, neurospheres têm sido fundamentais para estudar a jusante e up-regulação da expressão dos genes que codificam ou pequenos RNAs não-codificantes 11, a fim de investigar o seu papel na proliferação e diferenciação de células estaminais / progenitoras neurais peixe-zebra.

Zebrafish neurospheres primárias podem se auto-renovar a seguir várias passagens. Para gerar neuroesferas na passagem 1 e 2, os passos 5,1-5,4 foram repetidas duas vezes, num total de 6-8 dias. De DiV2-4, o tamanho das neuroesferas aumentada até cerca de 50 um de diâmetro. Neuroesferas secundárias e terciárias também foram obtidas depois da passagem 1 e 2, respectivamente (Figura 2D). No Passage 3, neurospheres peixe-zebra foram, contudo, incapaz de crescer com o tamanho crítico de 50 mm de diâmetro e não de auto-renovação, sugerindo que a nossa condição de cultura em vez seleciona um pool de células estaminais / progenitoras de uma população pura de células-tronco neurais 4 .

neurosphere Diferenciação

neurospheres primárias, secundárias ou terciárias derivadas a partir de qualquer whole do cérebro ou da telencefálico, cerebelar e área de tectal de peixe-zebra adulto foram testados para as suas potencialidades de diferenciação. Entre 1 e 3 dias in vitro em condições de diferenciação (DiVd1-DiVd3), uma monocamada de células aderentes foi observada (Figuras 3A, B). Tal como ilustrado na Figura 3C, a DiVd4, como projecções axonais, bem como células da glia foram visível e distinguível através da expressão do gene ou imuno analisa 11, avaliando que as células estaminais / progenitoras neurais tinha diferenciado. Da mesma forma, neurônios e células gliais diferenciadas a partir de células neuronais estaminais / progenitoras isoladas de diferentes territórios cerebrais (Figuras 3D, E).

Gene Expression Manipulação em Zebrafish neuroesferas

Nós testamos o papel de miR-107 na diferenciação neuronal e glial de todo peixe-zebra cérebro-de As células-tronco / progenitoras neurais RIVED (Figura 4). Mostrámos que a regulação negativa de miR-107 por anticorpos anti-miR-107 não afecta a formação de neuroesferas, mas a diferenciação neuronal alterada, como indicado pelo crescimento anormal dos processos axonais (Figuras 4A, B). análise da expressão do gene de RT-PCR confirmou que a inibição de miR-107 leva a um aumento da expressão de ambos o marcador de neuroblastos neurogenin-1 (NGN-1) e moléculas específicos dos axónios, tais como Map-2 e α-tubulina, sem afectar glial expressão do marcador de célula (S-100, GFAP, Olig2) (Figura 4C). Por conseguinte, o ganho de miR-107 por expressão de miR-107-mímica induziu uma diminuição da expressão do marcador específico e axónio neuroblast- (Figura 4D), avaliando que, in vitro, o miR-107 actua como um regulador de diferenciação neuronal durante o peixe-zebra neurogénese 11.

/53617/53617fig1.jpg "/>
Figura 1:. Representação esquemática do Protocolo Passos Os procedimentos eo calendário associado incluem a dissecção de qualquer todo o cérebro ou o telencefálicos tectal e regiões do cerebelo do cérebro peixe-zebra adulto (A, B), a obtenção de uma suspensão única célula (C ), a geração de neuroesferas flutuantes (D) e da diferenciação das neuroesferas (e).

Figura 2
Figura 2: Formação de neuroesferas Zebrafish derivado do cérebro. (A - C) As imagens de contraste de fase representativas de neuroesferas primárias derivadas do cérebro inteiro de flutuação observado no dia 1 (div1, A), dia 3 (Div3, B) e dia 4 (DiV4, C). (D) Gráfico que representa o número relativo de NEurospheres nas passagens 1 e 2 em comparação com o número neuroesfera na passagem 0. Após a passagem 2, a formação de neuroesferas foi drasticamente reduzida. Barra de escala: 25 ^ m.

Figura 3
. Figura 3: Diferenciação de neuroesferas Zebrafish derivado do cérebro (A - C, E), imagens de contraste de fase de inteiros neuroesferas derivadas do cérebro cultivadas no meio de Z-diferenciação durante um (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) e 4 (C e D, DiVd4) dias. View (E) dorsal de todo o cérebro de um velho Tg (GFAP: DsRed) 12 meses peixe-zebra. O telencéfalo (Tel), tectum (Tec) e cerebelo (Cer) foram dissecados e recolhidos, como mostrado. (D) Imagens de neuroesferas DiVd4 derivados do tectum, telencéfalo e ao cerebelo na passagem 0 (P0), 1 (P1) E 2 (P2). Barra de escala: 25 ^ m.

Figura 4
Figura 4:. Análise de neuroesferas formado após MiR107 Manipulação de imagens (A) de contraste de fase mostrando neurospheres Div4d tratados em Div4 com os oligonucleotídeos indicados. caixas pretas nos painéis superiores indicam a área ampliada nos painéis inferiores. Gráfico (B) superior representa a quantificação do número de neuroesferas formados com, ou sem, miR107. As neuroesferas são subdivididos pelo seu tamanho (20-30 um, 31-50 um,> 51 um de diâmetro). gráfico da parte inferior indica a quantificação das projeções axonal de neurospheres tratados e sub agrupados como acima. (C, D) Análise de expressão de qRT-PCR dos genes indicados por neuroesferas Div4d previamente tratados com oligonucleótidos indicados no Div4. Os dados representam osignifica ± SEM, * p <0,05, n = 3. Scr: disputa. Barra de escala: 25 ^ m.

Problema razão possível Solução
Recuperação de muitas células mortas atraso de tempo na preparação do cérebro antes do tratamento enzimático Certifique-se a dissecção configurar e media estão prontos antes de sacrificar o peixe (também verificar a esterilidade, temperatura)
tratamento papaína rigorosas dissociação mecânica tem de ser delicado o suficiente para gerar uma suspensão de célula única ao vivo, mas suficientemente forte para evitar deixando para trás muitos aglomerados de tecido. Respeite os horários recomendados e temperaturas para a incubação períodos / centrifugação
Neurospheres não aparecem ou crescer mal temperatura incorreta Verificar que a incubadora ajustada a 30 ° C é proporcionar a Ctemperatura orrect.
Crescimento esferas removidos com detritos Para cada poço, a aspiração dos detritos tem que ser um bom desempenho no topo do meio. Evite entrar no meio com a sua pipeta
A integridade de alguns reagentes (suplemento B27, EGF, FGF) é enfraquecida Esta integridade constitui fatores limitantes do crescimento celular. Verifique o número do lote, e as amostras de maneira foram preservados. Evite descongelar / recongelar ciclos de qualquer reagente amostragem utilizados na cultura
A presença de células individuais Modo de transferência / expansão do neurospheres é muito dura Este passo é um passo de expansão / diluição porque muitas esferas são formadas no poço. Evite coleção esfera dura durante a transferência para evitar a dissociação neurosphere em células individuais
Ausência de células em matrigel Matrigel não foi devidamente descongeladas / diluídos Matrigel de -20 ° C necessita de, pelo menos, 30 min a 4 ° C para descongelar e permanece viscoso Pipetar cuidadosamente
Sem aderência em matrigel O volume de suspensão de células tem que ser suficientemente pequeno para permitir a deposição de células sobre a pelagem de matrigel
Permitir mais tempo para a deposição de células (até 2 horas, se forem utilizados grandes volumes)
meio de diferenciação fresco muito frio Quando se substitui o meio de ligação celular, o meio de diferenciação tem de ser aquecido a 30 ° C para evitar o choque térmico sobre as células depositadas
pobre nucleofection As células mortas Certifique-se de que você não gerar bolhas de ar durante a execução de nucleofection. Use vectores de DNA de alta qualidade usando Maxi-preparações. Pelo menos 1-2 horas após nucleofection, substitua meio de cultura usando qualquer condição meio fresco Z-diferenciação ou médio Z-condição.
Poucos neurospheres positivos Neurospheres de tamanhos variados pode levar a uma má nucleofection. Usando neurospheres em div2 e Div3 são ideais para nucleofection. Densidade de células não deve ser superior a 4 x 10 ml -1 3 neuroesferas em uma reacção de 100 mL.

Tabela 1: Lista de problemas Advice, para cada etapa do protocolo, as questões possíveis e as soluções para superá-los.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O principal objectivo deste protocolo é o de isolar e cultivar peixe-zebra adulto neurospheres derivado do cérebro para estudar as características celulares e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais. Aqui, nós relatamos como selecionar células neurais multipotentes e gerar os três tipos de células neurais, ou seja, astrócitos, neurônios e oligodendrócitos, a partir do cérebro de peixe zebra adulta. O protocolo é altamente significativo uma vez que um ensaio de formação de neurosphere reprodutível não tinha sido estabelecido no peixe-zebra até agora.

A poucos passos críticos no protocolo precisa ser respeitada e foram recapitutaled na solução de problemas conselhos (Tabela 1). Em primeiro lugar, a morte celular ocorre tanto durante a dissecção do cérebro adulto peixe-zebra e o procedimento de suspensão de células individuais. Para limitar a extensão da morte celular, é imprescindível a utilização de ferramentas limpas e nítidas, bem como a respeitar estritamente o calendário e temperatura de incubação recomendada no presente proprotocolo. Em segundo lugar, a cultura neuroesfera deve ser realizada com meios recentemente preparadas e com uma técnica de pipetagem cuidadosa. , recomendações terceira densidade celular deve ser seguido para obter a renovação ou diferenciação de células de neuroesferas confiável. Com isto em mente, qualquer perito nas técnicas de cultura celular deve ser capaz de usar o protocolo e realizar o isolamento, cultura e manipulação de genes de neuroesferas derivado de cérebro de peixe zebra adultos.

Os ensaios de formação de esfera no peixe-zebra está a sofrer as mesmas limitações anteriormente descritos em espécies de mamíferos 4: 1) o comportamento das células-tronco / progenitoras neurais é alterada após o seu isolamento a partir de seu nicho de cérebro natural; 2) neuroesferas não são uma população homogénea de células estaminais, mas incluem células estaminais, células progenitoras, bem como células diferenciadas pós-mitóticas. Além disso, é interessante notar que nosso protocolo gera culturas de neuroesferas aclonal. A densidade celular de culturas éum parâmetro crítico em ensaios de formação de esferas, uma vez que determina a clonalidade, ou seja, se a cultura é clonal, semi-clonal ou aclonal. clonais condições permitem caracterizar com precisão e quantificar os diferentes grupos de células estaminais e progenitoras presentes na cultura. Nós não temos sido capazes de realizar ensaios de clonalidade de células até agora e nossas condições de cultura ainda precisa de mais otimização antes de nós pode discriminar células-tronco neurais de outras piscinas de células progenitoras.

culturas de neuroesferas Zebrafish pode ser utilizado para uma grande variedade de experiências. Eles permitem a análise da expressão de genes bem como a manipulação da expressão de genes durante a neurogénese como ilustrado pelo nosso estudo avaliando o miR-107 em função da determinação específica de tecido de destino da célula neural (Figura 4 e 11). Outras aplicações incluem estratégias de edição genoma, tais como o sistema CRISPR / Cas9, a fim de testar o papel dos genes estaminais / progenitoras neurais em neurogeNesis eo cérebro reparação 13. Finalmente, o nosso protocolo mostra que neuroesferas de peixe-zebra pode ser derivada a partir de diferentes regiões do cérebro de abrir a possibilidade de estudar características específicas da região de neurónios e células da glia e para explorar a base molecular e celular da heterogeneidade da célula neural em domínios ventriculares diferentes do cérebro de peixe zebra 14 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS 1x Life Technologies 14190-144
DMEM/F12 1x Life Technologies 11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate  Sigma C6852-25g
B-27 Life Technologies 17504-044
N-2 Life Technologies 17502-048 N-2 supplement (100x) liquid 
HEPES  Life Technologies 15630 1 M
D-(+)-Glucose 45%  Sigma G8769
Penicillin-streptomycin  Life Technologies 15140-122
Fetal Bovine Serum  Life Technologies 16000044
Human FGF-basic  Peprotech  100-18B
Human EGF  Peprotech AF-100-15
Insulin  Sigma I5500-50 mg
DNAse Sigma DN25-10mg
Papain  Worthington Biochemical Corporation LS003126
Matrigel  Becton Dickinson 356234
PFA  TCI P0018
PBS AmericanBio AB11072-04000
Tricaine MS-222 Sigma A5040 stock solution of 4 mg/ml. 
Trycold gel  Sigma TGP8 gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit Lonza VPI-1004
Trypan blue stain  Life Technologies 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
  2. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
  3. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
  4. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
  5. Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
  6. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  7. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  8. Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
  9. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
  10. Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
  11. Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
  12. Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
  13. Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).
  14. Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).

Tags

Biologia do Desenvolvimento Edição 108 Zebrafish neurogênese adultos células estaminais / progenitoras neurais ensaio neurosphere miRNA a manipulação genética
Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F.,… More

Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres. J. Vis. Exp. (108), e53617, doi:10.3791/53617 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter