Summary
여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.
Introduction
포유류 신경줄 기세포 (NSCs의)는 neurosphere를 1이라 세포의 클러스터로 분할 부동성 배양에서 성장하는 능력에 의해 시험 관내에서 특성화되었다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 NSCs의 자기 갱신 NSCs을 생성하기 위해 하나 대칭 분할 또는 비대칭 적으로 서로 다른 두 딸 세포를 생성하는 예., 미분 전구 세포 및 신규 NSC. Neurosphere 문화 따라서 신경 줄기 / 전구 세포보다 분화 된 신경 세포 2-4의 혼합물이다 NSCs을하지만,이 특정 속성에 의해 다른 neurosphere 세포 유형을 구별 할 수 있습니다. 그들은 자유에 장기 자기 갱신을 표시 문화 부동 그들은 세포 외 매트릭스 기판에 성장 인자의 철수 및 부착 다음 모든 신경 세포 계통 (즉, 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포)로 분화 할 수 있습니다. mamm에서ALS, neurosphere 배양 시스템은 성인 뇌 NSCs의 존재를 입증하는 데 사용되는 제 관내 시스템이고 증식자가 재생 능력과 신경 줄기 세포 및 선조 세포의 다 능성을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 도구가 남아있다. 따라서, 구 형성 분석법 단점과 한계 4 고통에도이 배양 시스템은 생체 내 틈새 (4)로부터 제거되어 키 레귤레이터 식별 쓸모 때 줄기 세포처럼 행동하는 세포의 잠재력을 평가하는데 유용 NSC 자기 갱신과 세포 운명 결정 5-7의.
성인 신경 제한된 포유류 달리 지브라 피쉬는 구조적 그들의 수명 동안 뇌 전체 축을 따라 새로운 뉴런을 생성한다. 제브라 피쉬 성인의 뇌는 t을 이해하기위한 제브라 피쉬에게 강력한 모델 생물을 신경 줄기 / 전구 세포를 품고 여러 신경 인성 틈새를 표시그 세포는 뇌 활동뿐만 아니라 중추 신경계 재생을위한 필요한 분자 프로그램 줄기. 지난 십칠년 동안 여러 연구 그룹은 분리하고 제브라 피쉬의 신경 세포 8,9 배양을위한 방법론을 개발했다. 이 연구는 배아 신경 세포 및 생체 외에서 아교 세포를 생산을 목표로,하지만 NSCs을 유지하고 그들의 특성을 조사하고 있었다. neurosphere를가 성인 Apteronotus의 leptorhynchus (브라운 유령 Knifefish) (10)에서 생성되었지만, 제브라 피쉬의 neurosphere 형성 분석은 설정 될 남아 있었다.
여기에서 우리는 제브라 피쉬의 신경 (11) 동안은 miR-107의 역할을 설명하기 neurosphere 형성 분석을 설명합니다. 프로토콜은 수 1) 지브라 피쉬 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 여러 해부 뇌 영역에서 어느 성인 신경 줄기 / 선조 세포의 수집; FL 2) 생성oating 성인 신경 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 neurosphere를; 3) 하향과 상향 조정 코딩하는 유전자 또는 작은 비 코딩 RNA를 neurosphere를 11의 표현의 순서는 신경 줄기 / 전구 세포의 증식 및 분화에서의 역할을 조사합니다.
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Protocol
WT CF 균주의 제브라 피쉬는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 프로토콜 번호 2012-11473)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 제기 및 유지 하였다. 모든 실험은 첫 번째 연구 목적으로 동물의 사용과 관련 기관을 규제하는 모든 관련 정부 및 기관 윤리의 승인을 받아야한다.
1. 준비
- , 해부 매체 10 ml의 준비의 200 μl를 추가 100X 페니실린 - 스트렙토 마이신 DMEM / F12의 9.8 ml의에.
- , 조직 배양 물 10 ㎖에 L 시스테인 120 mg의 추가 : L 시스테인 솔루션을 준비합니다. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 L 시스테인 솔루션을 저장, 또는 최대 1 년 -20 ° C에서 분취한다.
- DNase의에게 내가 솔루션을 준비 : 조직 배양 물 1 ㎖에, DNase의 I. 스토어 최대 2 개월 동안 4 ° C에서의 DNase I 용액 10 mg을 추가합니다.
- 파파인 솔루션을 준비 : 파파인 오디오 솔루션을 준비이온은 DMEM / F12의 5 ㎖로 100 ㎕를 파파인 (약 140 대), 100 μL의 DNase의 I (1 %) 200 μL의 L 시스테인 (12 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 갓 파파인 용액마다 준비하고 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터로 멸균.
- 세척 용액을 제조 :, 세척 용액 100 ㎖를 제조 93.85 ml의 DPBS 1 배에 포도당 45 %, 500 μL HEPES 1 M, 5 ML의 FBS를 650 μl를 추가 할 수 있습니다. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 세척 소독 용액. 최대 2 개월 동안 4 ° C에서 세정액을 저장합니다.
- 인슐린 솔루션을 준비 : 인슐린 용액 2 ㎖를 준비, 조직 배양 물 2 ㎖로 10 N 수산화 나트륨 100 mg의 인슐린의 25 μl의 드롭을 추가합니다.
- EGF와 FGF 솔루션을 준비 : 100 μg의 / ml의 농도로 DMEM / F12 모두 분열 촉진 물질을 용해. -20 ° C에서 10 μL 씩과 같은 보관하십시오.
- B-27, N-2 미디어를 준비합니다 저장 B-27 및 N-2 보충제를 500 μL로 -20 ° C 1 ml의 분취, respectiv에서엘리.
- Z 분화 조건 배지를 준비 : Z 분화 조건 배지 100㎖를 준비 40 μL 인슐린 (50 ㎎ / ㎖) 500 ㎕를 B-27 1 ㎖의 N-2, 650 μL의 포도당 45 % 및 1 ㎖를 추가 할 100 × 페니실린 - 스트렙토 마이신 DMEM / F12의 97.81 ml의에. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터 Z 분화 조건 배지를 멸균. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 Z-분화 조건 매체를 저장합니다.
- Z 조건 배지를 제조 : Z-조건 배지 50 ㎖를 준비 EGF 10 ㎕의 멸균 Z 분화 조건 배지 (20 NG / ㎖) 50 ㎖에 FGF의 10 μL를 추가. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 Z-조건 매체를 저장합니다.
- 분화 배양 코팅액을 제조 5 ml의 세포 외 도포 액에 대해, 세포 외 기질 용액 100 ㎕를 추가 DMEM / F12 4.9 ㎖ 중에 (예, 마트 리겔.). 얼음에 4 ℃에서 해동 세포 외 매트릭스 솔루션입니다. 일단 해동, 유 4 ℃에서 보관이주에 페이지.
성인 Zebrafish의 두뇌 2. 해부
- 젤 아이스 팩 100mm X 15mm 페트리 접시를 작성하여 침대 절개를 준비합니다. 그런 다음 페트리 접시에 뚜껑을 배치하고 젤이 정지 할 때까지 -20 ° C에서 품어. 뚜껑 장소의 위에 깨끗한 종이 필터의 사각형 필터 종이와 플라스틱 필름 배양 접시를 모두 마무리합니다.
- 깨끗하고 각 사용하기 전에 70 % 에탄올 또는 열에 의해 모든 미세 절제 장비를 소독. 해부 현미경 근처에 모든 멸균 해부 악기를 배치하고, 오른쪽 안락사 전에, 광섬유 조명 현미경 해부 침대를 배치합니다.
- 전체 뇌 neurosphere 준비를위한 2 성인 제브라 피쉬를 수집; 및 3-4 제브라 해부 뇌 영역에서 neurosphere를 생성한다.
- 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 성인 제브라 피쉬 (8~12개월 세)를 안락사. 다음으로, 7 물고기를 담그지5 % ~ 10 초 동안 에탄올 빠르게는 수술 블레이드를 사용하여 아가미의 수준에서 잘린 다음 해부 침대에 배치합니다.
- 동물의 심장 박동이 점차 둔화 및 순환이 멈출 때까지 과다 복용 tricaine의 메탄 (300 ㎎ / ℓ)를 관리, 동물을 안락사하려면 다음 아이스 물에 담그지.
- 아래로 머리 등의 측면을 돌려 가위를 사용하여 입 컷 측면에서 길이 절단을합니다. 집게를 사용하여 두개골의 기반을 노출하고 모든 인접 조직을 제거합니다. tectum으로 척수의 시작 부분에서 두개골의 측면 벽을 잘라.
- 위 사용 절단 시신경을 제거하고 tectum 수준에서 두개골의 가장 외측 부분의 양측을 제거한다. 머리 복부 쪽을 돌립니다. 두개골의 가장 꼭대기 부분의 나머지 부분을 떼어, 집게를 사용.
- 새로운 요리 위스콘신에 두개골의 나머지 부분과 뇌를 따라 이동해부 매체 (1.1) 토륨. 본래 모든 뇌 구조를 유지 마이크로 칼의 플라스틱 손잡이를 사용하여 해부 배지에서 뇌 조직을 청소한다.
- 이 시점에서, 전체 제브라 피쉬의 뇌를 사용하여 프로토콜을 계속합니다.
- 또는 전체 제브라 피쉬의 뇌에서 또는 신선한 메스로 해부 telencephalon, tectum / 간뇌 나 소뇌에서 neurosphere를 생성하는 특정 뇌 영역이 프로토콜을 적용. 3도 11를 참조 관심있어서의 뇌 영역을 해부 신경 특정 형광 제브라 피쉬의 신경 형질 전환 라인을 사용합니다.
성인 뇌의 3 단일 세포 해리
- 생물 안전 캐비닛에 모든 후속 작업을 수행합니다. 해부 배지 800 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 뇌 조직을 전송한다 (단계 1.1에서 제조). 뇌 조직을 건드리지 않고, 피펫 팅에 의해 해부 매체를 제거합니다.
- 파파인 용액 (단계 1.4) 500 μL를 첨가하고 10 분 동안 37 ° C에서 뇌 조직 다이제스트. 이 세포 생존 능력을 감소 수 있으므로 15 분 이상을 품어하지 마십시오.
- 배양 후, 바닥으로부터 ~ 0.25 인치 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 절삭 15ml의 원뿔형 튜브에 파파인 용액 500 μL와 뇌 조직 옮긴다. 조심스럽게 천천히 동일한 팁 상하 10 회 피펫 팅하여 뇌 조직을 해리. 최대 피펫 이상 15 배 아래로는 세포 생존을 변경할 수 있기 때문에,이 단계에서 공기 방울을 생성하지 마십시오.
- 미가공 1000 μL 정규 팁을 사용하여 10로 pipetting 분 뒤에 아래 10-13 시간 동안 37 ℃에서 다시 뇌 조직을 인큐베이션. 최대 피펫하지 않는 이상 15 배 아래로, 세포 사멸을 방지 할 수 있습니다.
- 실온 (RT)에서 5 분 800 XG에 세정액 (단계 1.5), 원심 분리 2 ㎖의 세포 현탁액을 첨가하여 효소 분해를 중지. 조심스럽게들 가만히 따르다upernatant 및 1,000 μL 일반 팁와 피펫 팅에 의해 아래로 격렬하게 손가락으로 다음 튜브를 눌러 남아있는 용액에 펠렛을 재현 탁. 이어서, 세척 용액 2 ㎖를 추가한다.
- 이 단계에서, 단일 세포 현탁액을 수득 한 현미경으로 확인한다. RT에서 5 분 동안 800 × g으로 다시 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 Z-조건 매체 (단계 1.10) 1 ㎖를 사용하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 트립 판 블루 (12)를 사용하여 세포를 염색 블루 사균을 제외하여 혈구를 사용하여 살아있는 세포 수를 계산. 세포 현탁액 200 ㎕를 각 웰에 신선한 Z-조건 매체의 300 μL와 24 웰 플레이트를 준비합니다. ~ 500 세포 / μL의 밀도에 씨앗 세포. 제브라 뇌 유래 neurosphere를 37 ℃에서 잘 성장하지 않기 때문에, 5 % CO 2에서 30 ° C에서 항온 배양 된 세포를 유지한다.
기본 neurosphere를의 4 세대 </ P>
- 시험 관내 (DiV1)에서 일일 후 현미경 성인 뇌 전체에서 얻은 단일 세포 현탁액을 관찰 파편이 웰의 중심에 축적 여부 참고. 조심스럽게 매체의 약 100 μl를 피펫 팅하여 이물질을 제거 (가능한 경우 이하). 다음 신선한 Z-조건 매체의 100 μl를 추가합니다. 단일 세포 현탁액이 시간 (그림 2A DiV1)에서 관찰해야한다.
- 체외에서 이일 (DIV2) 한 후, 배양 된 세포를 확장합니다. 팁 잘라 1,000 μL 피펫을 사용하여 수집하고 잘 새에 각 우물에서 세포 현탁액 250 μl를 전송합니다. 모든 우물에 신선한 Z-조건 매체의 250 μl를 추가합니다. 배양 된 세포를 확장하기 전에 잘 전반에 걸쳐 최대 피펫 팅에 의해 아래로 아주 부드럽게 정지를 균질화.
- 반복 시험 관내에서 다음 사일 (DiV4) 4.1 및 4.2 단계를 반복합니다. neurosphere를의 크기가 점진적 증가는 VI해야한다DiV3 및 DiV4 (도 2B와 C)의 중심과 가장자리에서 잘 sible.
주 : 기본 neurosphere를이 통로 또는 다 능성 분화를 평가하기 위해 처리 될 수있다. 대안 적으로, 이들은 분화 과정 중 특정 유전자의 역할을 특징 nucleofection 또는 리포 형질 11 처리 될 수있다.
기본 neurosphere를 5.과 Passaging
- 각 우물에서 조직 배양 250 μl를 제거하고 기계적으로 1 ml를 피펫으로 DiV4의 neurosphere를을 떼어 놓다. 너무 빨리 기포 형성이 세포 사멸을 증가 수 있으므로 아래 피펫하지 마십시오.
- 혈구 세포 수를 계산하고, 24 웰 플레이트의 각 웰에 일차 배양 상등액 250 ㎕의 800 세포 / μL를 배포한다.
- 각 웰에 Z-조건 매체의 250 μl를 추가합니다.
- 단계 4.2에보고 된 체외에서 이일 (DIV2) 한 후, 배양 된 세포를 확장D 4.3.
기본 neurosphere를 6. 차별화
- 10 분 동안 70 % 에탄올에 침지하여 커버 유리를 소독, 12 웰 플레이트의 각 웰에 그들을 배치하여 실온에서 건조 후 커버 유리.
- 그것은 넓게 확장하여 전체 커버 유리를 커버 할 수있는 방식으로, 커버 유리의 중앙에 세포 외 코팅액 (단계 1.11) 300 μL를 추가한다. 이어서, (습한 세포 배양기를 사용하여)을 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 배양 후 세포 코팅액을 제거하고 37 ℃에서 2 시간 동안 커버 유리를 건조.
- 각 우물에서 조직 배양 250 μl를 제거합니다. 기계적로 pipetting 아래로 (넓은 엔드 팁) 1 ml를 피펫으로 잘 따라 모든 DiV4 차 neurosphere를을 떼어 놓다.
- 종자는 미리 제조 외 기질 코팅 coverglasses 4 × 103 세포 / ml의 세포 밀도 (6.1-6 단계에서 neurosphere 세포 현탁액 해리.3) 기판에 부착 될 때까지, 5 % CO 2, 30 ℃에서 적어도 30 분 동안 유지한다. 이어서, 배지를 제거하고 빠르게 5 % CO 2에서 30 ° C에서 24 시간 동안 세포를 배양하기 전에 예열 신선한 Z 분화 조건 배지 (단계 1.9) 1 ㎖를 추가한다.
- 모든 이틀, 세포 분화의 시간 동안 Z-분화 조건 매체의 절반을 교체합니다.
기본 neurosphere를 7. 유전자 조작
- 4 ° C에서 80 x g에서 8 분 동안 원심 분리하여 DiV3-4 차 neurosphere를 (단계 4.3)를 수집합니다. 상업 oligonucleoatides의 리포좀 형질 전환 준비는 previouly 11 DNA 플라스미드 벡터의 nucleo - 형질을 설명했다.
- 반응 혼합물의 100 μL (82 μL의 nucleofactor 용액 보충 18 μL)에 4 × 103 세포 / μL의 세포 밀도로 재현 탁의 neurosphere 펠릿.
- neurosphere의 suspensi 믹스(1 μg의 / μL에서 플라스미드 주식) 선택의 DNA 플라스미드 벡터의 5 μL와 함께합니다. nucleotransfection에 대한 nucleofector 큐벳에 neurosphere / DNA 혼합물을 전송하고 nucleofector 키트에서 제공하는 제조업체의 지침에 따라 프로그램을 nucleofector 선택합니다.
- 즉시 nucleofection 후, 균체를 예열 Z 조건 배지 (1.10) 500 ㎖를 추가하고 전술 한 바와 같이, 이들 세포 재생 및 / 또는 분화 특성을 연구 형질 neurosphere를 플레이트.
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Representative Results
성인 Zebrafish의 Neurosphere 문화 일반 계획
여기에서 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서 수행 neurosphere 형성 분석의 프로토콜의 모든 단계를 설명합니다. 첫째, 성인 신경 줄기 / 전구 세포는 제브라 피쉬의 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 (도 1A-C) 등 여러 가지 해부하는 뇌 영역에서 하나 수집하고 있습니다. 성인 신경 줄기 / 선조 세포의 단일 세포 현탁액을 플로팅 자기 갱신 neurosphere를 (도 1D, E)를 생성하는데 사용되어왔다. 마지막으로, neurosphere를이 증식 및 제브라 피쉬의 신경 줄기 / 전구 세포의 분화에서 자신의 역할을 조사하기 위해 아래쪽을 공부에 최대 규제 코딩하는 유전자 또는 작은 비 코딩 RNA를 11의 표현의 수단이되고있다.
Zebrafish의 기본 neurosphere를 여러 통로를 따라 자기 갱신 할 수 있습니다. 항로 1과 2에서 neurosphere를 생성하기 위해, 5.1-5.4 6-8 일 총 두 번 반복 단계를 반복합니다. DiV2-4에서 neurosphere를의 크기는 직경이 약 50 ㎛의 최대 증가 하였다. 2 차 및 3 차 neurosphere를도 1 및 2 통로 각각 (도 2d) 후에 수득 하였다. 통로 (3)에서, 제브라 피쉬 neurosphere를 50 μm의 직경의 임계 크기로 성장 할 수 그러나 없습니다 우리의 문화 조건이 아니라 신경 줄기 세포 (4)의 순수한 인구보다 줄기 / 전구 세포의 풀을 선택하는 제안, 자기 갱신에 실패 .
Neurosphere 차별화
어느도 ë 유래의 1 차, 2 차 또는 3 차 neurosphere를성인 제브라 피쉬의 전자 두뇌 또는 telencephalic에서, 소뇌 및 tectal 지역은 분화 잠재력에 대해 시험 하였다. 분화 조건 (DiVd1-DiVd3) 시험 관내에서 1 3 일 사이에 부착 세포의 단층는 (도 3A, B)을 관찰 하였다. 도 3c에 도시 된 바와 같이, DiVd4에서뿐만 아니라 돌기 아교 세포와 같은 축삭은 면역 조직 또는 유전자 발현에 의해 표시와 구별 할 수 있었다 신경 줄기 / 선조 세포가 분화했다는 평가 (11)를 분석한다. 마찬가지로, 신경 세포와 아교 세포가 다른 뇌 영역 (도 3D, E)에서 분리 된 신경 줄기 / 전구 세포로부터 분화.
Zebrafish의 neurosphere를에서 유전자 발현 조작
우리는 전체 제브라 피쉬의 뇌 드의 신경 세포 및 교세포의 분화에은 miR-107의 역할을 테스트 한 으로 유도 된 신경 줄기 / 전구 세포 (그림 4). 우리는 축삭 처리 (도 4A, B)의 비정상적인 성장에 의해 표시된 바와 같이 반은 miR-107은 miR-107의 하향 조절은 neurosphere 형성되지만 변경된 뉴런 분화에 영향을 미치지 않았 음을 보여 주었다. RT-PCR 유전자 발현은 miR-107의 억제 신경교에 영향을주지 않고, neuroblast 마커 Neurogenin -1- (NGN-1) 및 MAP-2, α-tubulin의 아니라 축삭 특정 분자 모두의 발현 증가에 이르게 확인 분석 세포 마커 표현 (S-100, GFAP, Olig2) (도 4C). 따라서,에 의해은 miR-107 표현의 이득은 miR-107-모방은 평가, neuroblast- 및 축삭 특정 마커의 발현 (그림 4D)의 감소를 유도하는 체외에서 미르-107 행동 신경 분화 조절 등의 제브라 피쉬의 신경 중 11.
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그림 1 :. 프로토콜 단계의 개략적 인 절차와 관련된 타이밍 (B), 단일 세포 현탁액의 obtention (C를 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 및 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나의 절개를 포함 ) 부동 neurosphere를 (D) 및 neurosphere를 분화 (E)의 생성.
그림 2 : Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를 형성. (A - C) 전체 뇌 유래 차 부동 neurosphere를 대표 위상 콘트라스트 이미지는 3 일, 1 일 (DiV1, A)에서 관찰 (DiV3, B)과 4 일 (DiV4, C). NE의 상대적인 수를 나타내는 (D) 차트구절 1 및 2에서 urospheres 통로 (2)가 통과 한 후에 0으로 neurosphere 번호에 비해 크게 형성했다 neurosphere를 감소. 스케일 바 : 25 μm의.
. 그림 3 : Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분화 (A - C, E) 1시 Z-분화 배지에서 배양 전체 뇌 유래 neurosphere를의 위상 콘트라스트 이미지 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) 4 (C와 D, DiVd4) 일. 제브라 피쉬 : 12 개월 된 Tg를 (을 DsRed GFAP)의 전체 뇌의 (E) 도설보기. telencephalon (전화), tectum (TEC)와 소뇌 (CER)을 해부 그림과 같이 수집 하였다. (D) 항로 0 (P0)에서 tectum, telencephalon 및 소뇌에서 파생 된 DiVd4의 neurosphere를, 1 (P1의 이미지) 및 2 (P2). 스케일 바 : 25 μm의.
그림 4 :. 표시된 올리고 뉴클레오티드로 Div4에서 치료 Div4d의 neurosphere를을 보여주는 MiR107 조작 다음 결성 neurosphere를 분석 (A) 위상 콘트라스트 이미지. 상단 패널에 블랙 박스 하단 패널에서 확대 된 영역을 나타냅니다. (B) 위쪽 차트 또는 miR107없이 형성된 neurosphere를 수의 정량을 나타낸다. neurosphere를 자신의 사이즈 (20 ~ 30 μm의, 31-50 μm의 직경> 51 μm의)에 의해 아형된다. 아래 차트는 neurosphere를 처리하고 하위 위와 같이 그룹화에서 축삭 돌기의 정량화를 나타냅니다. 이전 Div4로 표시된 올리고 뉴클레오티드로 처리 된 neurosphere를 Div4d 의해 지시 유전자 (C, D) QRT-PCR 발현 분석. 데이터를 나타내는± SEM, * P <0.05, N = 3 SCR을 사용 의미 : 스크램블을. 스케일 바 : 25 μm의.
| 문제 | 가능한 이유 | 해결책 |
| 너무 많은 죽은 세포의 복구 | 효소 처리하기 전에 뇌를 준비 시간 지연 | 해부가 설정되었는지 확인하고 용지가 물고기를 희생하기 전에 준비 (또한 불임을 확인, 온도) |
| 엄격한 파파인 처리 | 기계 해리는 조직의 너무 많은 덩어리를 뒤에 남겨 피하기 위해 살아있는 단일 세포 현탁액을 생성 할만큼 섬세하지만, 충분히 강한 할 필요가있다. 배양 / 원심 분리 기간에 권장되는 시간과 온도를 존중 | |
| neurosphere를가 나타나거나 제대로 성장하지 않는다 | 잘못된 온도 | C를 제공하고 30 ° C로 설정하는 인큐베이터 확인orrect 온도. |
| 파편 제거 성장 분야 | 각 웰의 경우, 이물질의 흡인은 매체의 상단에 잘 수행 할 수있다. 당신의 피펫으로 매체에 입력하지 마십시오 | |
| 일부 시약의 무결성 (B27 보충제, EGF, FGF)가 약해진다 | 이 무결성은 세포 성장의 제한 요소를 구성한다. 배치 번호를 확인하고 방법 샘플을 보존했다. / 해동을 피 배양에 사용 된 샘플 시약의 사이클을 재 냉동 | |
| 단셀의 존재 | 전송 모드 / neurosphere를 확대 너무 가혹하다 | 너무 많은 분야가 잘 형성되어 있기 때문에이 단계에서는 확장 / 희석 단계이다. 하나의 세포로 neurosphere 분리를 방지하기 위해 전송하는 동안 가혹한 구 컬렉션을 피 |
| 마트 리겔에 세포의 부재 | 마트 리겔이 제대로 / 해동 희석되지 않았습니다 | -20 ° C에서 마트 리겔은 해동 4 ° C에서 최소 30 분을 필요로 조심스럽게 점성 피펫을 유지 |
| 마트 리겔에는 부착하지 | 세포 현탁액 부피의 Matrigel 코팅의 증착 셀을 허용하기에 충분히 작아야 | |
| 셀 증착을위한 더 많은 시간을 허용 (최대 큰 볼륨을 사용하는 경우 2 시간까지) | ||
| 신선한 차별화 매체가 너무 낮 | 세포 부착 배지 교환시, 분화 배지는 증착 셀에 열 충격을 방지하기 위해 30 ℃로 가온 할 필요 | |
| 가난한 nucleofection | 죽은 세포 | nucleofection을 수행하는 동안 공기 방울을 생성하지 않습니다 있는지 확인하십시오. 맥시 준비를 사용하여 높은 품질의 DNA 벡터를 사용합니다. 적어도 1 - nucleofection 후 2 시간, 신선한 Z-분화 조건 매체 또는 Z-조건 배지를 사용하여 배양 배지를 교체합니다. |
| 몇 가지 긍정적 인 neurosphere를 | 다양한 크기의 neurosphere를 가난한 nucleofection으로 이어질 수 있습니다. DIV2 및 DiV3에서 사용 neurosphere를이 nucleofection에 이상적이다. 세포의 밀도는 4 × 10 3 neurosphere를 ml의 -1 100 ㎖의 반응을 초과 할 수 없습니다. |
표 1 : 문제 해결 조언이 그들을 극복 할 수있는 프로토콜, 가능한 문제 및 솔루션의 각 단계에 대한 목록.
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Discussion
이 프로토콜의 주요 목표는 신경 줄기 / 전구 세포의 세포 및 분자 기능 연구를위한 분리 및 배양 성인 zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를하는 것입니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서, 다 능성 신경 세포를 선택하고 세 개의 신경 세포 유형, 즉, 성상 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성하는 방법을보고합니다. 재현성 neurosphere 형성 분석은 지금까지 제브라 피쉬 년에 설립되지 않은 때문에이 프로토콜은 매우 중요하다.
프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계는 존중해야하고 문제 해결에 대한 조언 (표 1)에 recapitutaled되었습니다. 우선, 세포 죽음은 성인 제브라 뇌 해부 및 단일 세포 현탁액 절차 둘 중에 발생한다. 이 세포 사멸의 확장 제한하기 위해서는 깨끗하고 날카로운 도구를 사용하여뿐만 아니라 엄격하게 본 프로에서 권장하는시기와 배양 온도를 존중하는 것이 필수적입니다로토콜. 둘째, neurosphere 문화 갓 준비 미디어 및주의 피펫 팅 기술로 수행해야합니다. 셋째, 세포 밀도 권장 신뢰성 갱신 또는 neurosphere 세포의 분화를 획득하기 위해 따라야한다. 이를 염두에두고, 세포 배양 기술에서 통상의 지식을 가진 사람이 프로토콜을 사용하는 성인 zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리, 배양 및 유전자 조작을 수행 할 수 있어야한다.
제브라 피쉬의 구 형성 분석은 이전 포유류 종 4에 설명 된 동일한 제한을 앓고 : 자연 뇌의 틈새에서 자신의 격리 다음 변경되는 신경 줄기 / 전구 세포의 1) 동작; 2) neurosphere를 줄기 세포의 동종 집단 아니지만, 줄기 세포, 전구 세포뿐 아니라 포스트 - 유사 분열 세포 분화를 포함한다. 그것은 우리의 프로토콜은 aclonal neurosphere 문화를 생성하는 것을주의 또한 가치가있다. 배양 세포 밀도는구 형성 분석에서 중요한 매개 변수는이 문화, 클론 세미 클론 또는 aclonal 여부, 즉 clonality을 결정하기 때문이다. 클론 조건은 정확하게 특성과 문화에 존재하는 줄기 및 전구 세포의 다른 풀을 정량화 할 수 있습니다. 우리는 지금까지 셀 clonality 분석을 수행 할 수 없었던 우리가 다른 전구 세포 풀에서 신경 줄기 세포를 구별하기 전에 우리의 배양 조건은 더욱 더 최적화가 필요합니다.
제브라 neurosphere 배양 실험의 큰 범위에 사용될 수있다. 신경 세포의 운명 (도 4 및도 11)의 결정 조직 특이 미르-107 함수를 평가하는 연구에 의해 도시 된 바와 같이 이들은 신경 동안 유전자 발현 분석뿐만 아니라 유전자 발현의 조작을 허용한다. 추가의 애플리케이션은 neuroge에서 신경 줄기 / 선조 유전자의 역할을 테스트하기 위해, 예컨대 CRISPR / Cas9 시스템으로 게놈 편집 전략을 포함nesis 뇌 수리 13. 마지막으로, 우리 프로토콜 제브라 neurosphere를는 뉴런 및 신경교 세포의 부위 별 기능을 연구하고 제브라 뇌 (14)의 서로 다른 심실 영역에서 신경 세포 이질성의 세포 및 분자 적 기초를 탐색 할 수있는 가능성을 열어 다른 뇌 영역에서 유도 될 수 있음을 보여준다 .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
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