Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro
Summary
Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
As células estaminais neurais de mamífero (NCCC) foram caracterizados in vitro pela sua capacidade para crescer em culturas de livre flutuação como aglomerados de células neuroesferas 1 denominadas dividindo. Na presença de factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), NSC dividir quer simetricamente para gerar NSC auto-renovação, ou assimetricamente para gerar duas células filhas diferentes, ie., Uma célula progenitora de diferenciação e um romance NSC. Culturas de neuroesferas são, portanto, uma mistura de células estaminais / progenitoras neuronais e células neurais diferenciadas mais 2-4 NSC pode, contudo, ser distinguido de outros tipos de células de neuroesferas por duas propriedades específicas:. Eles exibem a longo prazo de auto-renovação em LIVRE culturas flutuante e que podem se diferenciar em todas as linhagens de células neurais (isto é, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos e seguintes) retirada de factores de crescimento e adesão a substratos de matriz extracelulares. em mammALS, o sistema de cultura de neuroesferas foi o primeiro sistema in vitro utilizado para demonstrar a presença de NSC no cérebro adulto e mantém-se o instrumento mais vulgarmente utilizado para analisar a proliferação, capacidade de auto-renovação e multipotência de células estaminais e progenitoras neurais. Portanto, embora os ensaios de formação de esfera sofrem de algumas desvantagens e limitações 4, este sistema de cultura é valiosa para a avaliação do potencial de uma célula a comportar-se como uma célula estaminal quando removido do seu nicho in vivo 4 e tem contribuído para identificar reguladores chaves de NSC de auto-renovação e destino celular determinação 5-7.
Em contraste com os mamíferos que a neurogênese adulta limitados, peixe-zebra constitutivamente produzir novos neurônios ao longo de todo o eixo cérebro durante toda a sua vida. O cérebro de peixe zebra adulto exibe vários nichos neurogênicos abrigar células estaminais neuronais / progenitoras que fazem zebrafish um modelo poderoso organismo para a compreensão tEle stem a actividade de células no cérebro, bem como os programas molecular necessários para a regeneração do sistema nervoso central. Ao longo dos últimos 17 anos, vários grupos de pesquisa desenvolvida metodologias para o isolamento e cultura de células neurais zebrafish 8,9. Esses estudos tiveram como objetivo produzir neuronal embrionário e células gliais in vitro, mas não a manutenção NSCs e investigar suas propriedades. Embora neuroesferas foram gerados no adulto Apteronotus leptorhynchus (Brown fantasma knifefish) 10, um ensaio de formação de neuroesfera no peixe-zebra manteve-se a ser estabelecida.
Descrevemos aqui um ensaio de formação de neuroesfera para demonstrar o papel de miR-107 durante 11 neurogénese peixe-zebra. O protocolo permite que: 1) a coleta de células-tronco / progenitoras neurais adultas quer a partir do cérebro inteiro peixe-zebra ou de várias regiões cerebrais dissecados como o telencéfalo, a tectum, eo cerebelo; 2) a produção de FLflutuante e neurospheres auto-renovação das células-tronco / progenitoras neurais adultas; 3) a jusante e a sobre-regulação da expressão de genes que codificam ou pequenos RNAs não-codificantes nas neuroesferas 11, a fim de investigar o seu papel na proliferação e diferenciação de células estaminais / progenitoras neurais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O principal objectivo deste protocolo é o de isolar e cultivar peixe-zebra adulto neurospheres derivado do cérebro para estudar as características celulares e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais. Aqui, nós relatamos como selecionar células neurais multipotentes e gerar os três tipos de células neurais, ou seja, astrócitos, neurônios e oligodendrócitos, a partir do cérebro de peixe zebra adulta. O protocolo é altamente significativo uma vez que um ensaio de formação de neurosp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O’Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
