Выделение и культура взрослых данио мозга, полученных из нейросферах
Summary
Здесь мы предлагаем воспроизводимый метод для изучения нейрогенез с использованием анализа нейросфера, полученную из целого мозга или от или конечного мозга, tectal или мозжечка областей взрослых данио мозга. Кроме того, мы опишем процедуру манипулировать экспрессии генов в данио нейросферах.
Abstract
The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.
Introduction
Млекопитающие нервные стволовые клетки (NSC , ) были охарактеризованы в пробирке их способности расти в свободно плавающих культур как кластеры делящиеся клетки называются нейросферы 1. В присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF), NSC , делят либо симметрично , чтобы генерировать самообновлению NSCs, или асимметрично , чтобы генерировать два разных дочерних клеток, то есть., Дифференцирующим клеток – предшественников и новый НСК. Поэтому нейросфера культуры представляют собой смесь нервных стволовых клеток / клеток- предшественников и более дифференцированных нервных клеток 2-4 NSC , может, тем не менее, следует отличать от других типов клеток нейросфера двумя специфическими свойствами:. Они показывают долгосрочное самообновление в FREE- плавающей культур , и они могут дифференцироваться во все нейронных клеточных клонов (то есть, нейроны, астроциты и олигодендроциты) после снятия факторов роста и адгезии к внеклеточного матрикса подложках. В MAMMALS, система нейросфера культура была первая система в пробирке используется для демонстрации присутствия NSCs во взрослом мозге и остается наиболее часто используемым инструментом для анализа пролиферации, способность самообновления и мультипотентность нервных стволовых клеток и клеток – предшественников. Поэтому, несмотря на то, сфера формирования анализы страдают от некоторых недостатков и ограничений 4, эта система культуры является ценным для оценки потенциала клетки , чтобы вести себя как стволовые клетки при извлечении его из своей ниши в естественных условиях 4 и играет важную роль в определении ключевых регуляторов НСК самообновлению и клеточной судьбы определения 5-7.
В отличие от млекопитающих, которые имеют ограниченный нейрогенез, данио конститутивно производят новые нейроны вдоль всей оси мозга на протяжении всей их жизни. Данио мозг взрослого человека показывает множественные нейрогенные нишах укрывательство нервных стволовых / клеток-предшественников делает Zebrafish мощную модель организма для понимания тон стволовых активность клеток в головном мозге, а также молекулярные программы, необходимые для регенерации центральной нервной системы. За последние 17 лет, несколько исследовательских групп разработаны методики выделения и культивирования данио нервных клеток 8,9. Эти исследования были направлены на получение эмбриональных нейронов и глиальных клеток в пробирке, но не при поддержании NSCs и исследовать их свойства. Хотя нейросферы были сформированы во взрослом Apteronotus leptorhynchus (Brown Дух Knifefish) 10, A нейросфера формирования анализа в данио осталось установить.
Здесь мы опишем нейросфера формирования анализа , чтобы продемонстрировать роль микроРНК-107 во время данио нейрогенез 11. Протокол позволяет: 1) совокупность взрослых нервных стволовых клеток / клеток-предшественников либо из данио всего мозга или из нескольких вскрытых областей мозга, таких как телэнцефалона, тектуме и мозжечка; 2) генерация фли с плавающей самообновляющихся нейросферы из взрослых клеток нервных стволовых / прогениторных; 3) понижающего и повышающей регуляции экспрессии генов , кодирующих или малых некодирующих РНК 11 в нейросферах, для того , чтобы исследовать их роль в пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток / клеток – предшественников.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основной целью этого протокола является, чтобы изолировать и культуры взрослых данио мозга, полученных нейросферы для изучения клеточных и молекулярных особенностей нервных стволовых клеток / клеток-предшественников. Здесь мы сообщаем о том , как выбрать мультипотентных нервных клет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).
Materials
| DPBS 1X | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1X | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O’Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
