Summary
هنا نقدم طريقة استنساخه لدراسة الخلايا العصبية الكبار باستخدام الفحص neurosphere المستمدة من الدماغ كله أو إما من الدماغ الانتهائي، سقفي أو المناطق المخيخ من الكبار الدماغ الزرد. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الإجراء لمعالجة التعبير الجيني في neurospheres الزرد.
Introduction
تم التعرف على الثدييات الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في المختبر عن طريق قدرتها على النمو في الثقافات التعويم الحر كعناقيد تقسيم خلايا تسمى neurospheres 1. في وجود عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل)، NSCs تنقسم إما بشكل متناظر لتوليد NSCs تجديد الذات، أو غير متماثلة لتوليد خليتين ابنة مختلفة، مثلا، بسبب التمييز خلية سلفية ومجلس الأمن القومي الرواية. لذا الثقافات Neurosphere هي خليط من الخلايا الجذعية / السلف العصبية والخلايا العصبية أكثر متباينة 2-4 NSCs يمكن، مع ذلك، يمكن تمييزها عن غيرها من neurosphere الخلايا أنواع من قبل اثنين من خصائص محددة: لأنها تكشف المدى الطويل التجديد الذاتي في احلرية العائمة الثقافات وأنها يمكن أن تفرق في كل الأنساب الخلية العصبية (أي الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes) بعد الانسحاب من عوامل النمو والانضمام إلى ركائز المصفوفة خارج الخلية. في mammاعتلال الأعصاب الحركية، وكان نظام الثقافة neurosphere أول نظام في المختبر تستخدم للتدليل على وجود NSCs في الدماغ الكبار ويبقى أداة الأكثر استخداما لتحليل الانتشار، والقدرة على التجديد الذاتي وmultipotency الخلايا الجذعية والسلف العصبية. لذلك، على الرغم من المقايسات تشكيل المجال تعاني من بعض العيوب والقصور 4، وهذا النظام الثقافة هو قيمة لتقييم احتمال وجود خلية لتتصرف كما الخلايا الجذعية عند إزالتها من في الجسم الحي المتخصصة (4) وقامت بدور فعال في تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية مجلس الأمن القومي التجديد الذاتي ومصير خلية تقرير 5-7.
وعلى النقيض من الثدييات الذين تقتصر تكوين الخلايا العصبية الكبار، الزرد إنتاج خلايا عصبية جديدة بشكل جوهري على طول محور الدماغ كاملة طوال حياتهم. يعرض الدماغ الزرد الكبار متعددة المنافذ العصبية إيواء الجذعية العصبية خلية / السلف جعل الزرد قوية نموذج حي لفهم روقال انه وقف نشاط الخلايا في الدماغ وكذلك برامج الجزيئية المطلوبة لتجديد الجهاز العصبي المركزي. على مدى السنوات ال 17 الماضية، وضعت عدة مجموعات بحثية منهجيات لعزل وزراعة الخلايا العصبية الزرد 8،9. وتهدف هذه الدراسات إلى إنتاج الخلايا العصبية الجنينية والخلايا الدبقية في المختبر، ولكن ليس على الحفاظ على NSCs والتحقيق ممتلكاتهم. على الرغم من neurospheres تم توليدها في Apteronotus leptorhynchus الكبار (براون شبح Knifefish) 10، بقي مقايسة تشكيل neurosphere في الزرد التي سيتم إنشاؤها.
نحن هنا وصف مقايسة تشكيل neurosphere للتدليل على دور مير-107 خلال تكوين الخلايا العصبية الزرد 11. يتيح البروتوكول: 1) مجموعة من الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار إما من الدماغ كله الزرد أو من عدة مناطق الدماغ تشريح مثل الدماغ الانتهائي، والسقف، والمخيخ. 2) جيل من فلوريداoating وneurospheres تجديد الذات من الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار. 3) لأسفل ويصل تنظيم التعبير عن الجينات الترميز أو الرنا غير الترميز الصغيرة 11 في neurospheres، من أجل تحقيق دورهم في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية / السلف العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأثيرت الزرد من سلالة WT CF والمحافظة وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها المؤسسي جنة رعاية واستخدام الحيوان جامعة ييل (IACUC البروتوكول رقم 2012-11473). ينبغي أولا الموافقة على جميع التجارب التي كتبها كل الأخلاق الحكومية والمؤسسية ذات الصلة التي تنظم الهيئات بشأن استخدام الحيوانات لأغراض البحث.
1. التحضيرات
- إعداد 10 مل من المتوسط تشريح، إضافة 200 ميكرولتر من 100X البنسلين، الستربتوميسين إلى 9.8 مل من DMEM / F12.
- يعد حل-L السيستين: 10 مل من الماء لزراعة الأنسجة، وإضافة 120 ملغ من L-السيستين. تخزين حل L السيستين في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع، أو في aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
- إعداد الدناز أنا الحل: 1 مل من الماء لزراعة الأنسجة، وإضافة 10 ملغ من الدناز أولا مخزن الدناز أنا الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
- يعد حل غراء: لإعداد غراء solutأيون، إضافة 100 ميكرولتر غراء (ما يقرب من 140 وحدة)، و 100 ميكرولتر الدناز الأول (1٪) و 200 ميكرولتر L-السيستين (12 ملغ / مل) في 5 مل من DMEM / F12. حديثا تحضير محلول غراء في كل مرة وتعقيم مع 0.22 ميكرون حجم المسام مرشح قبل الاستخدام.
- يعد حل الغسيل: لتحضير 100 مل من محلول الغسيل، إضافة 650 ميكرولتر الجلوكوز 45٪، 500 ميكرولتر HEPES 1 م و 5 مل FBS إلى 93.85 مل DPBS 1X. تعقيم الحل غسل 0.22 ميكرون حجم المسام مرشح قبل الاستخدام. تخزين حل غسل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
- يعد حل الأنسولين: لإعداد 2 مل من محلول الأنسولين، إضافة قطرة 25 ميكرولتر من 10 N هيدروكسيد الصوديوم و 100 الأنسولين ملغ في 2 مل من الماء لزراعة الأنسجة.
- إعداد الحلول EGF وجمعية جيل المستقبل: حل كلا mitogens في DMEM / F12 على 100 ميكروغرام تركيز / مل. تخزين تصل إلى 10 مكل في -20 درجة مئوية.
- إعداد وسائل الاعلام B-27 و N-2: متجر B-27 و N-2 المكملات الغذائية في -20 درجة مئوية إلى 500 ميكرولتر و 1 مل قسامات، respectivاعل.
- إعداد Z-التمايز حالة متوسطة: لتحضير 100 مل من Z-التمايز حالة متوسطة، إضافة 40 ميكرولتر الأنسولين (50 ملغ / مل)، 500 ميكرولتر B-27، 1 مل N-2، 650 ميكرولتر الجلوكوز 45٪ و 1 مل من 100 × البنسلين، الستربتوميسين إلى 97.81 مل من DMEM / F12. تعقيم حالة متوسطة Z-التمايز مع 0.22 ميكرون حجم المسام مرشح قبل الاستخدام. تخزين المتوسطة حالة Z-التمايز في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
- إعداد Z-حالة متوسطة: لإعداد 50 مل من وسائل الاعلام Z-حالة، إضافة 10 ميكرولتر من EGF و 10 ميكرولتر من جمعية جيل المستقبل إلى 50 مل من معقم المتوسطة حالة Z-التمايز (20 نانوغرام / مل). تخزين متوسطة Z-حالة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
- يعد حل طلاء للثقافة التمايز: لمدة 5 مل خارج الخلية حل طلاء، إضافة 100 ميكرولتر من حل المصفوفة خارج الخلية إلى 4.9 مل من DMEM / F12 (على سبيل المثال، Matrigel). ذوبان حل المصفوفة خارج الخلية في 4 درجات مئوية على الجليد. مرة واحدة تفقد تجميدها، والحفاظ على 4 درجات مئوية لمدة شص إلى 2 أسابيع.
2. تشريح الدماغ الكبار الزرد
- إعداد تشريح سرير عن طريق ملء 100 ملم × 15 ملم طبق بيتري مع حزم هلام الجليد. ثم وضع غطاء على طبق بتري واحتضان عند -20 درجة مئوية حتى تجميد هلام. على أعلى من مكان غطاء مربع من ورق الترشيح نظيفة والتفاف على حد سواء ورقة الترشيح وطبق بتري مع فيلم من البلاستيك.
- نظيفة وتعقيم جميع الأدوات تسليخ مجهري بنسبة 70٪ من الإيثانول أو الحرارة قبل كل استعمال. وضع جميع الأدوات تشريح تعقيمها قرب المجهر تشريح، والحق قبل القتل الرحيم، وضع السرير تشريح تحت المجهر مع إضاءة الألياف البصرية.
- جمع 2 الزرد الكبار لإعداد neurosphere الدماغ كله. و3-4 الزرد لتوليد neurospheres من مناطق الدماغ تشريح.
- الموت ببطء الزرد الكبار (8-12 شهرا) باستخدام بروتوكول افقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي. بعد ذلك، تزج الأسماك في 75٪ من الإيثانول لمدة 5-10 ثانية وبسرعة وضع في السرير تشريح تليها قطع الرأس على مستوى الخياشيم باستخدام شفرة جراحية.
- إلى الموت ببطء الحيوانات، إدارة جرعة زائدة (300 ملغم / لتر) من methanesulfonate تريكين حتى يبطئ ضربات القلب الحيوان تدريجيا وتوقف الدورة الدموية، ثم تزج في الماء المثلج.
- تحويل رئيس الجانب الظهري أسفل، وباستخدام مقص جعل قطع طولية من الجانب قطع في الفم. باستخدام ملقط فضح قاعدة الجمجمة، وإزالة جميع الأنسجة المجاورة. قطع الجدران الجانبية من الجمجمة من بداية الحبل الشوكي نحو السقف.
- باستخدام مقص، وقطع وإزالة الأعصاب البصرية ثم قم بإزالة جانبي الجزء الأكثر الوحشي من الجمجمة في مستوى السقف. بدوره رئيس بطني حتى الجانب. باستخدام الملقط، تقشر بقية الجزء الأكبر قمية من الجمجمة.
- نقل الدماغ جنبا إلى جنب مع الجزء المتبقي من الجمجمة إلى واي طبق جديدث المتوسطة تشريح (1.1). تنظيف أنسجة المخ في المتوسط تشريح باستخدام مقبض من البلاستيك السكين الصغير، والحفاظ على جميع الهياكل الدماغ سليمة.
- من هذه النقطة، مواصلة بروتوكول استخدام الدماغ الزرد كله.
- بدلا من التكيف مع هذا البروتوكول إلى مناطق محددة في الدماغ لتوليد neurospheres من الدماغ الزرد كله أو من الدماغ الانتهائي، السقف / الدماغ البيني أو المخيخ تشريح مع مشرط جديد. استخدام خط الفلورسنت معين العصبي الزرد العصبي المعدلة وراثيا لتشريح المنطقة الدماغ فيها وفقا تهم الشكل 3 ومرجع 11.
3. التفكك خلية واحدة من الدماغ الكبار
- أداء جميع الأعمال اللاحقة في خزانة السلامة البيولوجية. نقل أنسجة المخ في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 800 ميكرولتر من المتوسطة تشريح (المعد في الخطوة 1.1). إزالة المتوسطة تشريح من قبل pipetting، دون لمس أنسجة المخ.
- إضافة 500 ميكرولتر من محلول غراء (الخطوة 1.4) وهضم أنسجة المخ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. لا احتضان أطول من 15 دقيقة لأنها يمكن أن تقلل بقاء الخلية.
- بعد مرور فترة الحضانة، ونقل أنسجة المخ مع 500 ميكرولتر من محلول غراء في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل باستخدام 1000 ميكرولتر قطع طرف الماصة في ~ 0.25 بوصة من أسفل. فصل بلطف أنسجة المخ من قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا 10 مرات مع نفس الطرف. لا الماصة صعودا وهبوطا أكثر من 15 مرة ولا تولد فقاعات الهواء خلال هذه الخطوة، لأنه يمكن أن يغير بقاء الخلية.
- احتضان أنسجة المخ مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها pipetting صعودا وهبوطا 10-13 مرة باستخدام 1000 ميكرولتر طرف المنتظم تقطيعه. لا الماصة صعودا وهبوطا أكثر من 15 مرة، لتجنب موت الخلايا.
- وقف عملية الهضم الأنزيمي بإضافة 2 مل من غسل الحل (الخطوة 1.5)، وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 800 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). صب بعناية لياليupernatant و resuspend بيليه في حل ما تبقى من خلال الاستفادة من أنبوب بقوة مع إصبع ومن ثم من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع 1000 ميكرولتر طرف منتظم. المقبل، إضافة 2 مل من محلول الغسيل.
- في هذه المرحلة، والتحقق من تحت المجهر الذي تم الحصول على تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي تعليق الخلية مرة أخرى في 800 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه باستخدام 1 مل من جديد متوسطة Z-حالة (الخطوة 1.10).
- خلايا صمة عار باستخدام التريبان الأزرق 12 و عد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات من خلال استبعاد الخلايا الميتة الزرقاء. إعداد 24 لوحة جيدا مع 200 ميكرولتر من تعليق خلية و 300 ميكرولتر من Z-حالة جديدة المتوسطة في كل بئر. خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من ~ 500 خلية / ميكروليتر. الحفاظ على الخلايا المستزرعة في حاضنة عند 30 درجة مئوية في 5٪ CO 2، منذ neurospheres الزرد المستمدة من الدماغ لا تنمو جيدا عند 37 درجة مئوية.
4. توليد الابتدائية Neurospheres </ P>
- بعد 1 يوم في المختبر (DiV1)، ومراقبة تعليق خلية واحدة تم الحصول عليها من الكبار الدماغ كله تحت المجهر ونلاحظ ما إذا كان قد تراكم الحطام في وسط البئر. بعناية إزالة أي حطام من قبل pipetting ما يقرب من 100 ميكرولتر من المتوسطة (أقل إن أمكن). التالي إضافة 100 ميكرولتر من Z-حالة جديدة المتوسطة. ينبغي مراعاة تعليق خلية واحدة في هذا الوقت (الشكل 2A DiV1).
- بعد 2 أيام في المختبر (DIV2)، وتوسيع الخلايا المستزرعة. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع خفض الحافة، جمع ونقل 250 ميكرولتر من تعليق خلية من كل بئر إلى بئر جديدة. إضافة 250 ميكرولتر من Z-حالة جديدة المتوسطة في جميع الآبار. قبل توسيع الخلايا المستزرعة، التجانس تعليق بلطف شديد من قبل pipetting صعودا وهبوطا في جميع أنحاء البئر.
- كرر الخطوات من 4.1 و 4.2 لمدة 4 أيام التالية في المختبر (DiV4). وينبغي أن تكون الزيادة التدريجية في حجم neurospheres السادسsible في المركز وحواف البئر في DiV3 وDiV4 (الشكل 2B و C).
ملاحظة: neurospheres الأولية يمكن معالجة للمرور أو التمايز لتقييم multipotency. بدلا من ذلك، فإنها يمكن أن تتم معالجتها لnucleofection أو ليبو-ترنسفكأيشن 11 لتوصيف دور جينات معينة خلال عملية التمايز.
5. الركض الابتدائية Neurospheres
- إزالة 250 ميكرولتر من زراعة الأنسجة من كل بئر وميكانيكيا فصل neurospheres DiV4 مع ماصة 1 مل. لا الماصة صعودا وهبوطا بسرعة كبيرة كما تشكيل فقاعة الهواء قد زاد موت الخلايا.
- عدد الخلايا مع عدادة الكريات وتوزيع 800 خلية / ميكرولتر في 250 ميكرولتر من طاف الثقافة الأساسي في كل بئر من 24 لوحة جيدا.
- إضافة 250 ميكرولتر من Z-حالة المتوسطة إلى كل بئر.
- بعد 2 أيام في المختبر (DIV2)، وتوسيع الخلايا المستزرعة كما ذكرت في الخطوة 4.2 لد 4.3.
6. تمايز الابتدائية Neurospheres
- تعقيم النظارات غطاء عن طريق الغمر في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة، ثم غطاء الجافة النظارات في RT عن طريق وضعها في كل بئر من لوحة ال 12 أيضا.
- إضافة 300 ميكرولتر من محلول طلاء خارج الخلية (الخطوة 1.11) في وسط غطاء زجاجي في مثل هذه الطريقة أنه يمكن توسيع نطاق واسع وتغطية الزجاج غطاء كامل. ثم، في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (باستخدام الخلايا ترطيب الثقافة الحاضنة).
- إزالة حل طلاء خارج الخلية بعد الحضانة، وتجفيف الزجاج غطاء لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
- إزالة 250 ميكرولتر من زراعة الأنسجة من كل جانب. ميكانيكيا فصل كل neurospheres الأساسي DiV4 لكل بئر مع ماصة 1 مل (مع تلميح نهاية أوسع) من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- فصل البذور تعليق خلية neurosphere في مناطق ذات كثافة خلية من 4 × 10 3 خلية / مل على coverglasses المغلفة المصفوفة خارج الخلية معدة مسبقا (خطوة 6،1-6.3) والاحتفاظ لمدة 30 دقيقة على الأقل، عند 30 درجة مئوية في 5٪ CO 2، حتى تعلق على الركيزة. ثم، وإزالة مستنبت وإضافة بسرعة 1 مل من قبل حرارة جديدة Z-التمايز حالة المتوسطة (الخطوة 1.9) قبل زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة على 30 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- كل يومين، محل نصف حالة متوسطة Z-التمايز في زمن differentation الخلية.
7. التلاعب الجيني الابتدائية Neurospheres
- جمع DiV3-4 neurospheres الأساسي (الخطوة 4.3) بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 80 ز س في 4 درجات مئوية. الاستعداد لترنسفكأيشن الحويصلية من oligonucleoatides التجارية وصفها بأنها previouly 11 أو نواة ترنسفكأيشن ناقلات البلازميد.
- بيليه resuspend neurosphere في مناطق ذات كثافة خلية من 4 × 10 3 خلية / ميكرولتر في 100 ميكرولتر من خليط التفاعل (82 ميكرولتر حل nucleofactor و 18 ميكرولتر من الملحق).
- مزيج من أنظمة التعليق neurosphereعلى مع 5 ميكرولتر من ناقلات البلازميد من خيار (الأسهم البلازميد في 1 ميكروغرام / ميكرولتر). نقل الخليط neurosphere / الحمض النووي في كفيت nucleofector لnucleotransfection وحدد nucleofector البرنامج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة التي قدمتها عدة nucleofector.
- مباشرة بعد nucleofection، إضافة حجم 500 مل من قبل تحسنت وسائل الإعلام Z-حالة (1.10) إلى الخلايا ولوحة للneurospheres transfected لدراسة تجديد الخلايا و / أو خصائص التمايز، كما هو موضح أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مخطط العام للاسماك الزرد الكبار Neurosphere الثقافة
نحن هنا وصف جميع الخطوات من بروتوكول مقايسة تشكيل neurosphere تنفيذها من الكبار الدماغ الزرد. أولا، تم جمع الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار إما من الدماغ كله الزرد أو من عدة مناطق الدماغ تشريح مثل الدماغ الانتهائي، والسقف والمخيخ (الشكلان 1A-C). وبعد ذلك استخدمت تعليق خلية واحدة من الخلايا الجذعية / السلف العصبية الكبار لتوليد العائمة وneurospheres تجديد الذات (أرقام 1D، E). وأخيرا، كانت neurospheres دور فعال في دراسة لأسفل ويصل تنظيم التعبير عن الجينات الترميز أو الرنا الصغيرة غير الترميز 11 من أجل تحقيق دورهم في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية / السلف العصبية الزرد.
ف together.within الصفحات = "1"> Neurosphere الركض
يمكن neurospheres الأساسي الزرد تجديد الذات بعد عدة فقرات. لتوليد neurospheres في الممر 1 و 2، الخطوات تكررت 5،1-5،4 مرتين، في ما مجموعه 6-8 أيام. من DiV2-4، زاد حجم neurospheres تصل إلى حوالي 50 ميكرون في القطر. وقد تم الحصول على neurospheres الثانوي والعالي أيضا بعد مرور 1 و 2 على التوالي (الشكل 2D). في الممر 3، كان neurospheres الزرد ولكن غير قادر أن يكبر في الحجم الحرج من 50 ميكرون قطر وفشلت في تجديد الذات، مما يشير إلى أن حالة ثقافتنا بدلا يختار مجموعة من الخلايا الجذعية / السلف من السكان نقية من الخلايا الجذعية العصبية 4 .
Neurosphere التمايز
neurospheres الابتدائي والثانوي أو الجامعي المستمدة إما من جملةتم اختبار البريد الدماغ أو من الدماغ الانتهائي، المخيخ ومنطقة سقفي من الزرد الكبار لإمكانات المفاضلة الخاصة بهم. بين 1 و 3 أيام في المختبر في ظروف التمايز (DiVd1-DiVd3)، لوحظ وجود أحادي الطبقة من الخلايا الملتصقة (أرقام 3A، B). كما هو موضح في الشكل 3C، في DiVd4، كانت محور عصبي مثل التوقعات وكذلك خلايا الدبقية مرئية ويمكن تمييزها من قبل immunohistological أو التعبير الجيني يحلل 11، وتقييم تلك العصبية الخلايا الجذعية / السلف ومتباينة. وبالمثل، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية متباينة من الخلايا الجذعية / السلف العصبية معزولة عن الأراضي الدماغ المختلفة (أرقام 3D، E).
الجينات التلاعب التعبير في الزرد Neurospheres
لقد اختبرنا دور مير-107 على تمايز الخلايا العصبية والدبقية من كامل الزرد الدماغ دي rived العصبية الخلايا الجذعية / السلف (الشكل 4). أظهرنا أن downregulation من مير-107 عن طريق مكافحة مير-107 لم يؤثر على تشكيل neurosphere لكن تمايز الخلايا العصبية تغير، كما يدل على ذلك نمو غير طبيعي للعمليات محور عصبي (الأرقام 4A، B). التعبير الجيني RT-PCR التحليلات وأكد أن تثبيط مير-107 يؤدي إلى زيادة تعبير عن كل من علامة أرومة عصبية Neurogenin-1 (NGN-1) وجزيئات محور عصبي معين، مثل خريطة-2 و α تويولين، دون أن يؤثر ذلك الدبقية التعبير الخلية علامة (S-100، GFAP، Olig2) (الشكل 4C). وبناء على ذلك، فإن المكسب من مير 107 التعبير مير-107-تقليد الناجم عن انخفاض التعبير علامة neuroblast- ومحور عصبي محددة (الشكل 4D)، وتقييم ذلك، في المختبر، مير-107 بمثابة منظم تمايز الخلايا العصبية خلال الخلايا العصبية الزرد 11.
/53617/53617fig1.jpg "/>
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لخطوات بروتوكول الإجراءات وتوقيتها المرتبطة تشمل تشريح إما الدماغ كله أو الدماغ الانتهائي، سقفي والمناطق المخيخ من الكبار الدماغ الزرد (A، B)، وobtention من تعليق خلية واحدة (C )، وتوليد neurospheres العائمة (D) والتفريق بين neurospheres (E).
الشكل 2: تشكيل المستمدة الدماغ الزرد Neurospheres. (A - C) المرحلة التمثيلية على النقيض من الصور من neurospheres الأساسي كله المستمدة من الدماغ عائمة لاحظت في يوم 1 (DiV1، A)، يوم 3 (DiV3، B) ويوم 4 (DiV4، C). (D) الرسم البياني الذي يمثل العدد النسبي من شمال شرقurospheres في المقاطع 1 و 2 مقارنة بعدد neurosphere في الممر 0. بعد مرور 2، neurospheres كان تشكيل تراجعا حادا. شريط الحجم: 25 ميكرون.
. الشكل (3): تمايز Neurospheres المستمدة الدماغ الزرد (A - C، E) الصور المرحلة النقيض من neurospheres المستمدة من الدماغ كله مثقف في المتوسط Z-التمايز خلال 1 (A، DiVd1) و 3 (ب، DiVd3) و 4 أيام (C و D، DiVd4). عرض (E) الظهرية من الدماغ كله من تيراغرام القديم (GFAP: عن dsRed) 12 الشهر الزرد. تم تشريح الدماغ الانتهائي (أبيب)، السقف (تك) والمخيخ (حدات خفض الانبعاثات المعتمدة) والتي تم جمعها كما هو مبين. (D) صور neurospheres DiVd4 المستمدة من السقف، الدماغ الانتهائي والمخيخ في الممر 0 (P0)، 1 (P1) و 2 (P2). شريط الحجم: 25 ميكرون.
الشكل 4: تحليل Neurospheres تشكلت بعد MiR107 التلاعب الصور (A) المرحلة النقيض تظهر neurospheres Div4d العلاج في Div4 مع أليغنوكليوتيد المشار إليها. صناديق سوداء في أعلى وحات تشير إلى منطقة تضخيم في لوحات أسفل. (ب) أعلى الرسم البياني يمثل الكمي لعدد من neurospheres شكلت مع أو بدون، miR107. وsubgrouped Neurospheres من حجمها (20-30 ميكرون، 31-50 ميكرومتر،> 51 ميكرون في القطر). الرسم البياني السفلي يشير إلى تقدير حجم التوقعات محور عصبي من neurospheres المعالجة وشبه مجمعة على النحو الوارد أعلاه. (C، D) تحليل التعبير QRT-PCR من الجينات أشار neurospheres Div4d تعامل سابقا مع [أليغنوكليوتيد أشار في Div4. تمثل البياناتيعني ± SEM، * ف <0.05، ن = 3. قرار مجلس الأمن: التدافع. شريط الحجم: 25 ميكرون.
| مشكلة | الأسباب المحتملة | حل |
| استرداد عدد كبير جدا من الخلايا الميتة | تأخير الساعة في إعداد الدماغ قبل العلاج الأنزيمية | تأكد من تعيين تشريح حتى وسائل الإعلام جاهزة قبل التضحية الأسماك (أيضا التحقق من العقم، ودرجة الحرارة) |
| العلاج غراء صارمة | التفكك الميكانيكية يجب أن يكون حساسة بما يكفي لتوليد تعليق خلية واحدة حية، ولكن قوية بما يكفي لتجنب تاركا وراءه الكثير من كتل من الأنسجة. احترام مرات ودرجات الحرارة الموصى بها لفترات حضانة / الطرد المركزي | |
| Neurospheres لا تظهر أو تنمو بشكل سيئ | درجة الحرارة غير صحيحة | تأكد من أن مجموعة حاضنة عند 30 درجة مئوية وتوفير جدرجة الحرارة orrect. |
| تزايد المجالات إزالتها مع الحطام | لكل بئر، تطلع الحطام لابد من أداء جيدا على أعلى من المتوسط. تجنب الدخول في المتوسط مع الماصة الخاصة بك | |
| تضعف سلامة بعض الكواشف (ملحق B27، EGF، جمعية جيل المستقبل) | وتشكل هذه النزاهة العوامل التي تحد من نمو الخلايا. تحقق رقم الدفعة، وحفظت طريقة العينات. تجنب ذوبان الجليد / اعادة تجميد دورات في أي كاشف عينات المستخدمة في الثقافة | |
| وجود خلايا واحدة | طريقة نقل / توسيع neurospheres قاس جدا | هذه الخطوة هي خطوة التوسع / تخفيف لأن تتشكل العديد من المجالات في البئر. تجنب جمع المجال قاسية أثناء النقل لمنع التفكك neurosphere إلى الخلايا وحيدة |
| غياب الخلايا على matrigel | تم Matrigel لا إذابة صحيح / المخفف | Matrigel من -20 ° C يحتاج على الأقل 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لذوبان الجليد ويبقى لزج الماصة بعناية |
| لا التصاق على matrigel | حجم التعليق الخلية يجب أن تكون صغيرة بما يكفي للسماح ترسب الخلايا على معطف matrigel | |
| إتاحة المزيد من الوقت لترسب الخلايا (تصل إلى 2 ساعة إذا تم استخدام كميات أكبر) | ||
| التمايز جديدة متوسطة البرودة | عند استبدال المتوسطة خلية المرفق، يحتاج المتوسطة التمايز إلى أن تكون درجة حرارة تصل إلى 30 درجة مئوية لمنع الصدمة الحرارية على الخلايا المودعة | |
| nucleofection الفقراء | الخلايا الميتة | تأكد من أنك لا تولد فقاعات الهواء أثناء أداء nucleofection. استخدام ناقلات الحمض النووي جودة عالية باستخدام ماكسي الاستعدادات. على الأقل 1 - 2 ساعة بعد nucleofection، تحل محل الثقافة المتوسطة باستخدام إما طازجة Z-التمايز حالة متوسطة أو Z-حالة متوسطة. |
| قليل من neurospheres إيجابي | Neurospheres من أحجام مختلفة ويمكن أن يؤدي إلى سوء nucleofection. باستخدام neurospheres في DIV2 وDiV3 مثالية لnucleofection. يجب ألا تتجاوز كثافة الخلايا 4 × 10 3 neurospheres مل -1 في تفاعل 100 مل. |
الجدول 1: نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها قائمة، على كل خطوة من البروتوكول، والقضايا المحتملة والحلول للتغلب عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو عزل وثقافة الكبار neurospheres الزرد المستمدة من الدماغ لدراسة الخصائص الخلوية والجزيئية للخلايا الجذعية / السلف العصبية. هنا، ونحن التقرير كيفية اختيار الخلايا العصبية متعددة القدرات وتوليد أنواع الخلايا العصبية ثلاثة، أي الخلايا النجمية، الخلايا العصبية و oligodendrocytes، من الكبار الدماغ الزرد. بروتوكول مهم للغاية منذ مقايسة تشكيل neurosphere استنساخه لم ينشأ في الزرد حتى الآن.
في حاجة الى بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول أن تكون محترمة وتم recapitutaled في المشورة استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 1). أولا، يحدث موت الخلايا خلال كل من تشريح الدماغ الكبار الزرد وإجراءات تعليق خلية واحدة. للحد من توسيع لموت الخلايا، لا بد من استخدام أدوات نظيفة وحادة وكذلك على احترام بدقة توقيت ودرجة حرارة الحضانة الموصى بها في الموالي الحاليtocol. ثانيا، يجب أن يتم تنفيذ الثقافة neurosphere مع وسائل الإعلام الطازجة ومع تقنية pipetting لمتأنية. وينبغي أن يتبع الثالثة، توصيات كثافة الخلية للحصول على تجديد موثوق أو تمايز الخلايا neurosphere. مع هذا في الاعتبار، وينبغي أن يكون أي شخص من ذوي المهارات في مجال تقنيات لزراعة الخلايا قادرة على استخدام بروتوكول وتنفيذ العزلة والثقافة والجينات التلاعب neurospheres المستمدة من الدماغ الزرد الكبار.
المقايسات تشكيل المجال في الزرد يعاني من نفس القيود التي سبق وصفها في أنواع الثدييات 4: 1) سلوك الخلايا الجذعية / السلف العصبية يتم تبديل التالية عزلتهم من مكانة المخ الطبيعية. 2) neurospheres ليسوا من السكان متجانسة من الخلايا الجذعية، ولكن تشمل الخلايا الجذعية، الخلايا الاولية وكذلك خلايا متباينة بعد الإنقسامية. وعلاوة على ذلك فمن الجدير بالذكر أن بروتوكول لدينا يولد الثقافات neurosphere aclonal. كثافة الخلية الثقافات هيمعلمة حرجة في المقايسات تشكيل المجال لأنه يحدد قابلية التنسيل، أي ما إذا كانت الثقافة هي نسيلي، شبه نسيلي أو aclonal. شروط نسيلي تسمح للتميز بدقة وتحديد تجمعات مختلفة من الجذعية والسلف خلايا موجودة في الثقافة. ونحن لم تكن قادرة على أداء المقايسات خلية قابلية التنسيل حتى الآن، والظروف ثقافتنا لا يزال بحاجة إلى مزيد من التحسين قبل أن نتمكن من تمييز الخلايا الجذعية العصبية من حمامات خلية سلفية أخرى.
الثقافات neurosphere الزرد يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التجارب. أنها تسمح تحليل التعبير الجيني، وكذلك التلاعب في التعبير الجيني خلال تكوين الخلايا العصبية كما يتضح من دراستنا تقييم مير-107 وظيفة في تحديد الأنسجة محددة من الخلايا العصبية مصير (الشكل 4 و 11). وتشمل تطبيقات إضافية استراتيجيات تحرير الجينوم، مثل كريسبر / نظام Cas9، من أجل اختبار دور الجينات الجذعية / السلف العصبية في neurogenesis والدماغ إصلاح 13. وأخيرا، يظهر بروتوكول لدينا أن neurospheres الزرد يمكن استخلاصها من مناطق الدماغ المختلفة وفتح إمكانية لدراسة الخصائص الخاصة بكل منطقة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، واستكشاف الأساس الخلوي والجزيئي للتجانس الخلايا العصبية في المجالات البطين مختلفة من الدماغ الزرد 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J.
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
