Summary
Hier stellen wir ein reproduzierbares Verfahren adulte Neurogenese zu untersuchen, aus dem gesamten Gehirn stamm eine Neurosphäre Assay verwendet oder von entweder dem telencephalic, tectal oder cerebellar Regionen des adulten Gehirns Zebrabärbling. Zusätzlich beschreiben wir das Verfahren der Genexpression in Zebrabärbling Neurosphären zu manipulieren.
Introduction
Mammalian neurale Stammzellen (NSC) wurden in freischwimmenden Kulturen als Cluster von sich teilende Zellen genannt Neurospheres 1 in vitro durch ihre Fähigkeit , zu wachsen charakterisiert. In Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), NSC dividieren entweder symmetrisch selbst erneuernden NSC zu erzeugen, oder asymmetrisch zwei verschiedenen Tochterzellen zu erzeugen, dh., Eine differenzierende Vorläuferzelle und eine neuartige NSC. Neurosphere Kulturen sind daher eine Mischung aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen und differenzierten neuralen Zellen 2-4 NSC kann jedoch aus anderen Neurosphäre Zelltypen von zwei spezifischen Eigenschaften unterscheiden:. Sie in Freilangfristigen Selbsterneuerungs anzuzeigen Floating - Kulturen und sie können in allen neuralen Zelllinien (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) nach Entzug der Wachstumsfaktoren und Adhäsion an extrazelluläre Matrixsubstraten unterscheiden. in mammals die Neurosphärenkultur - System war das erste in - vitro - System verwendet , um die Anwesenheit von NSC im erwachsenen Gehirn zu zeigen , und ist die am häufigsten verwendeten Werkzeug Proliferation, Selbsterneuerungskapazität und Multipotenz von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen zu analysieren. Deshalb, auch wenn Kugel bildenden Tests von einigen Nachteilen und Einschränkungen 4 ist dieses Kultursystem ist wertvoll für das Potential einer Zelle Auswertung als Stammzelle zu verhalten , wenn sie 4 aus seiner in vivo Nische entfernt und hat bei der Identifizierung von Schlüsselregulatoren instrumental von NSC Selbsterneuerung und Zellschicksal Bestimmung 5-7.
Im Gegensatz zu den Säugetieren, die adulte Neurogenese beschränkt haben, Zebrabärbling produzieren konstitutiv neue Neuronen entlang der gesamten Gehirns Achse während ihrer gesamten Lebensdauer. Der Zebrabärbling erwachsenen Gehirn zeigt mehrere neurogenen Nischen neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen beherbergen ein leistungsfähiges Modellorganismus machen Zebrabärbling t für das Verständniser Stammzellaktivität im Gehirn sowie die molekularen Programme für das zentrale Nervensystem die Regeneration erforderlich. In den letzten 17 Jahren entwickelte sich mehrere Arbeitsgruppen Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Zebrabärbling neuralen Zellen 8,9. Diese Studien wurden bei der Herstellung embryonalen neuronalen und Glia - Zellen , in vitro gerichtet, aber nicht auf NSC Aufrechterhaltung und Untersuchung ihrer Eigenschaften. Obwohl Neurosphären haben im erwachsenen Apteronotus leptorhynchus (Brown - Geist Messerfisch) 10, ein Neurosphären-Bildungstest in der Zebrabärbling blieb etabliert werden generiert.
Hier beschreiben wir eine Neurosphere-Bildungstest die Rolle der miR-107 während der Zebrabärbling Neurogenese 11 zu demonstrieren. Das Protokoll ermöglicht: 1) die Sammlung von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen entweder von Zebrabärbling gesamte Gehirn oder aus mehreren seziert Hirnregionen wie das Telencephalon, Tectum und Cerebellum; 2) die Erzeugung von flFlie und selbst erneuernden Neurosphären von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen; 3) die Down- und Hochregulation der Expression von kodierenden Genen oder kleine nicht-kodierenden RNAs 11 in Neurosphären, um ihre Rollen bei der Proliferation und Differenzierung von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen zu untersuchen.
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Protocol
Zebrabärbling des Stammes WT CF wurden erhöht und konstant gehalten gemäß Protokollen , die von der Animal Care und Use Committee Institutional Yale University genehmigt (IACUC Protokollnummer 2012-11473). Alle Versuche sollten zunächst von allen relevanten staatlichen und institutionellen Ethik Regulierungsbehörden in Bezug auf die Verwendung von Tieren zu Forschungszwecken zugelassen werden.
1. Vorbereitungen
- Bereiten Sie 10 ml Dissektion Medium, 200 & mgr; l von 100x Penicillin-Streptomycin in 9,8 ml DMEM / F12.
- Bereiten L-Cystein-Lösung: 10 ml Wasser für die Gewebekultur, fügen 120 mg L-Cystein. Speichern die L-Cystein-Lösung bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen oder in Aliquots bei -20 ° C für bis zu 1 Jahr.
- Bereiten Sie DNase I-Lösung: 1 ml Wasser für die Gewebekultur, mit 10 mg DNase I. Lagern Sie die DNase I-Lösung bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.
- Bereiten Sie Papain Lösung: Papain solut vorbereiten100 & mgr; l Papain (etwa 140 Einheiten), 100 & mgr; l DNase I (1%) und 200 & mgr; l L-Cystein (12 mg / ml) in 5 ml DMEM / F12-Ion, hinzuzufügen. Frisch vorbereiten mit einem 0,22 & mgr; m Porengröße Filter vor dem Gebrauch jedes Mal, wenn der Papain-Lösung und sterilisieren.
- Bereiten Waschlösung: 100 ml Waschlösung herzustellen, fügen Sie 650 ul Glucose 45%, 500 ul HEPES 1 M und 5 ml FBS in 93,85 ml DPBS 1x. Sterilisieren Sie die Waschlösung mit einem 0,22 & mgr; m Porengröße Filter vor dem Gebrauch. Speichern die Waschlösung bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.
- Bereiten Insulinlösung: 2 ml Insulinlösung herzustellen, fügen einen 25 ul Tropfen 10 N NaOH und 100 mg Insulin in 2 ml Wasser für die Gewebekultur.
- Bereiten EGF und FGF-Lösungen: Man löst beide Mitogene in DMEM / F12 mit 100 ug / ml-Konzentration. Store als 10 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C.
- Bereiten B-27 und N-2-Medien: Shop B-27 und N-2 ergänzt bei -20 ° C bis zu 500 & mgr; l und 1 ml Aliquots, JEWEILIGENely.
- Bereiten Z-Differenzierung Zustand Medium: 100 ml Z-Differenzierung Zustand Medium herzustellen, dann werden 40 & mgr; l Insulin (50 mg / ml), 500 ul B-27, 1 ml N-2, 650 & mgr; l Glucose 45% und 1 ml 100 x Penicillin-Streptomycin in 97,81 ml DMEM / F12. Sterilisieren Sie die Z-Differenzierung Zustand Medium mit einem 0,22 & mgr; m Porengröße Filter vor dem Gebrauch. Lagern Sie die Z-Differenzierung Zustand Medium bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
- Bereiten Z-Zustand Medium: 50 ml Z-Zustand Medien vorzubereiten, fügen Sie 10 ul EGF und 10 ul FGF in 50 ml sterile Z-Differenzierung Zustand Medium (20 ng / ml). Lagern Sie den Z-Zustand Medium bei 4 ° C für bis zu 1 Woche.
- Bereiten Sie Beschichtungslösung für die Differenzierung Kultur: 5 ml extrazelluläre Beschichtungslösung, 100 & mgr; l der extrazellulären Matrix - Lösung in 4,9 ml DMEM / F12 (zB Matrigel.). Thaw extrazelluläre Matrix-Lösung bei 4 ° C auf Eis. Einmal aufgetaute halten bei 4 ° C für up bis 2 Wochen.
2. Dissection des Adult cerebra-
- Bereiten Sie ein, indem ein 100 mm x 15 mm Petrischale mit Gel Eisbeutel Bett Dissektion. Dann legen Sie den Deckel auf die Petrischale und Inkubation bei -20 ° C, bis das Gel gefriert. Auf der Oberseite des Deckels Platz ein Quadrat von sauberen Filterpapier und wickeln sowohl das Filterpapier und Petrischale mit Plastikfolie.
- Reinigen und Sterilisieren alle microdissection Instrumente um 70% Ethanol oder Wärme vor jedem Gebrauch. Legen Sie alle sterilisierten Dissektionsinstrumente in der Nähe des Binokular und direkt vor Euthanasie, legen Sie das Sezieren Bett unter dem Mikroskop mit einer optischen Faserbeleuchtung.
- Sammeln Sie 2 erwachsenen Zebrafisch für ein ganzes Gehirn Neurosphere Vorbereitung; und 3 bis 4 Zebrabärbling Neurosphären aus sezierten Hirnregionen zu erzeugen.
- Euthanize Erwachsenen Zebrabärbling (8-12 Monate alt) ein Protokoll, das von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt werden. Als nächstes tauchen die Fische in 75% Ethanol für 5-10 sec und legen schnell in der Dissektion Bett durch Enthauptung auf der Ebene der Kiemen folgte eine chirurgische Klinge.
- Um Tiere einschläfern, zu verwalten eine Überdosis (300 mg / l) von Tricaine Methansulfonat, bis der Herzschlag des Tieres allmählich verlangsamt und die Zirkulation stoppt, tauchen dann in Eiswasser.
- Drehen Sie den Kopf Rückenseite nach unten und mit der Schere machen einen Längsschnitt von der Schnittseite bis zur Mündung. Mit Hilfe der Zange setzen die Basis des Schädels und entfernen Sie alle angrenzenden Gewebe. Geschnitten, um die Seitenwände des Schädels vom Anfang des Rückenmarks in Richtung des Tectum.
- Mit der Schere, schneiden und die Sehnerven zu entfernen, und entfernen Sie dann beide Seiten der meisten seitlichen Teil des Schädels auf der Ebene des Tectum. Drehen Sie den Kopf Bauchseite nach oben. Mit einer Pinzette, um den Rest der apikalsten Teil des Schädels abzulösen.
- Übertragen, das Gehirn zusammen mit dem restlichen Teil des Schädels in eine neue Schale with die Dissektion Medium (1.1). Reinigen Sie das Hirngewebe in der Dissektion Medium der Mikromesser Kunststoffgriff, wobei alle Hirnstrukturen intakt.
- Von diesem Punkt weiterhin das Protokoll, das die ganze cerebra- verwenden.
- Alternativ anpassen dieses Protokoll spezifischen Hirnregionen Neurosphären aus ganzen cerebra- oder aus Telenzephalon, Tectum / Dienzephalon oder Cerebellum mit einem frischen Skalpell seziert zu erzeugen. Verwenden Sie ein neuronales spezifische fluoreszierende Zebrabärbling neuronale transgene Linie die Hirnregion von Interesse nach sezieren auf Figur 3 und 11 verweisen.
3. Single Cell Dissoziation von adulten Gehirn
- Führen Sie alle nachfolgenden Arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank. Übertragen, das Hirngewebe in ein 1,5 ml Röhrchen mit 800 ul Dissektion Medium (hergestellt in Schritt 1.1). Entfernen Sie die Dissektion Medium durch Pipettieren, ohne das Hirngewebe zu berühren.
- Hinzufügen 500 ul Papain-Lösung (Schritt 1.4) und zu verdauen das Hirngewebe bei 37 ° C für 10 min. Nicht brüten mehr als 15 Minuten, da sie die Lebensfähigkeit der Zellen verringern könnte.
- Nach der Inkubation übertragen das Hirngewebe mit 500 ul der Papain-Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen ein 1000 ul Pipettenspitze Schnitt bei ~ 0,25 Zoll vom Boden verwendet wird. auf und ab pipettieren 10 Mal mit der gleichen Spitze vorsichtig distanzieren, indem Sie langsam das Hirngewebe. Pipettieren nicht nach oben und unten mehr als das 15-fache und nicht Luftblasen bei diesem Schritt erzeugen, wie es die Lebensfähigkeit der Zellen verändern könnten.
- Inkubieren wieder das Hirngewebe bei 37 ° C für 10 min, gefolgt von Auf- und Abpipettieren 10-13 mal eine ungeschnittene 1000 ul regelmäßige Spitze verwenden. Pipettieren nicht nach oben und unten mehr als 15 Mal, um zu verhindern Zelltod.
- Stoppt den enzymatischen Verdau durch Zugabe von 2 ml Waschlösung (Schritt 1.5), und die Zellsuspension Zentrifuge bei 800 × g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Vorsichtig umfüllen supernatant und das Pellet in der verbleibenden Lösung resuspendieren durch das Rohr kräftig mit einem Finger tippen und dann durch Auf- und Abpipettieren mit einem 1000 ul regelmäßigen Spitze. Als nächstes wurden 2 ml Waschlösung hinzufügen.
- In diesem Stadium prüfen unter dem Mikroskop, das eine einzige Zellsuspension erhalten wurde. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wieder bei 800 g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml frischem Z-Zustand Medium (Schritt 1.10).
- Stain Zellen durch Trypanblau-12 mit und zählen die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer unter Ausschluss blauen toten Zellen. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 200 ul Zellsuspension und 300 ml frisches Z-Zustand Medium in jeder Vertiefung. Samenzellen in einer Dichte von ~ 500 Zellen / & mgr; l. Pflegen kultivierten Zellen in einem Inkubator bei 30 ° C in 5% CO 2, da Zebrabärbling Gehirn stammNeuroSphären wachsen nicht gut bei 37 ° C.
4. Erzeugung von Primärneurosphären </ P>
- Nach 1 Tag in vitro (div1), beachten Sie die einzelnen Zellsuspension aus dem erwachsenen ganze Gehirn unter dem Mikroskop erhalten und beachten Sie, ob Ablagerungen in der Mitte des gut angesammelt hat. Entfernen Sie vorsichtig alle Ablagerungen von etwa 100 ul Medium Pipettieren (weniger wenn möglich). Als nächstes fügen Sie 100 ml frisches Z-Zustand Medium. Einzelzellsuspensionen sollten zu diesem Zeitpunkt (2A div1) beobachtet werden.
- Nach 2 Tagen in vitro (div2), die kultivierten Zellen erweitern. Mit einem 1000 ul Pipette mit der Spitze schneiden, zu sammeln und übertragen 250 ul Zellsuspension aus jeder Vertiefung in einen Brunnen neu. In 250 ml frisches Z-Zustand Medium in alle Vertiefungen. Bevor die kultivierten Zellen expandiert, homogenisieren der Suspension sehr sanft durch Pipettieren nach oben und unten im ganzen gut.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2 für den folgenden 4 Tagen in vitro (DIV4). Eine progressive Zunahme der Größe von Neurosphären sollte vi seinlich in der Mitte und die Kanten des Bohrloches bei DIV3 und DIV4 (2B und C).
Hinweis: Primäre Neurosphären können für den Durchgang oder die Differenzierung verarbeitet werden Multipotenz zu beurteilen. Alternativ können sie für Nukleofektion oder Lipo-Transfektion 11 werden verarbeitet , um die Rolle spezifischer Gene während des Differenzierungsprozesses zu charakterisieren.
5. Passagierung der primären Neurosphären
- Entfernen 250 ul Gewebekultur aus jeder Vertiefung und mechanisch DIV4 Neurosphären mit einer 1 ml Pipette distanzieren. Nicht pipettieren nach oben und unten zu schnell als Luftblasenbildung Zelltod erhöht werden.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und verteilen 800 Zellen / ul in 250 ul primären Kulturüberstand in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- In 250 ul Z-Zustand Medium zu jeder Vertiefung.
- Nach 2 Tagen in vitro (div2), erweitern die kultivierten Zellen , wie in Schritt 4.2 eine berichtetd 4.3.
6. Differenzierung von primären Neurosphären
- Sterilisieren Deckgläser durch Eintauchen in 70% Ethanol für 10 min, dann trocken Deckgläser bei RT, indem sie in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte platzieren.
- Hinzufügen von 300 & mgr; l von extrazellulärem Beschichtungslösung (Schritt 1.11) in der Mitte des Deckglases in der Weise, dass es weit verbreitet und decken die gesamte Deckglas erweitern. Dann wird für 1 h bei 37 ° C inkubieren (der befeuchteten Zellkulturbrutschrank verwendet wird).
- Entfernen Sie die extrazelluläre Beschichtungslösung nach der Inkubation und trockne das Deckglas für 2 h bei 37 ° C.
- Entfernen 250 ul Gewebekultur aus jeder Vertiefung. Mechanisch distanzieren alle DIV4 primären Neurosphären pro Vertiefung mit einer 1 ml Pipette (mit breiteren-Endrohr) durch Pipettieren von oben und unten.
- Seed dissoziierten Neurosphären Zellsuspensionen bei einer Zelldichte von 4 x 10 3 Zellen / ml auf zuvor hergestellte extrazelluläre Matrix beschichteten Deckgläsern (Schritt 6.1-6.3) und Halten für mindestens 30 min bei 30 ° C in 5% CO 2, bis an dem Substrat befestigt. Dann entfernen Sie das Kulturmedium und schnell 1 ml vorgewärmter Frisch Z-Differenzierung Zustand Medium (Schritt 1.9) , bevor die Zellen 24 Stunden lang bei 30 ° C in 5% CO 2 kultiviert werden .
- Alle zwei Tage ersetzen die Hälfte der Z-Differenzierung Zustand Medium während der Zeit der Zelldifferenzierung.
7. Genmanipulation von primären Neurosphären
- Sammeln DiV3-4 primären Neurosphären (Schritt 4.3) von 8 Minuten bei 80 x g zentrifugiert bei 4 ° C. Bereiten Sie sich auf Liposom - Transfektion von kommerziellen oligonucleoatides wie previouly 11 oder Nucleo-Transfektion von DNA - Plasmid - Vektoren.
- Resuspendieren Neurosphärenpellet mit einer Zelldichte von 4 x 10 3 Zellen / ul in 100 ul einer Reaktionsmischung (82 ul Nucleofactor Lösung und 18 & mgr; l zu ergänzen).
- Mischen Sie die Neurosphere Schutzsperreauf mit 5 ul der DNA-Plasmid-Vektoren der Wahl (Plasmid-Aktien bei 1 ug / ul). Übertragen Sie die Neurosphere / DNA-Mischung in eine Nucleofector Küvette für nucleotransfection und wählen Sie Nucleofector Programm gemäß der von der Nucleofector Kit enthaltenen Anweisungen des Herstellers.
- Unmittelbar nach Nukleofektion ein Volumen von 500 ml vorgewärmten Z-Zustand Medien (1.10) zu den Zellen und die Platte der transfizierten Neurosphären für das Studium ihrer Zellerneuerung und / oder Differenzierung Eigenschaften hinzufügen, wie oben beschrieben.
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Representative Results
Allgemeine Schema des Adult Zebrabärblinge Neurosphäre Kultur
Hier beschreiben wir alle Schritte des Protokolls eines Neurosphere-Bildungstest von den Erwachsenen cerebra- durchgeführt. Zunächst adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen entweder von Zebrabärbling gesamte Gehirn oder aus mehreren seziert Hirnregionen wie das Telencephalon gesammelt worden ist , Tectum und Cerebellum (1A-C). Einzelzellsuspension von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen wurden dann verwendet schwimmende und selbst erneuernden Neurosphären (Figuren 1D, E) zu erzeugen. Schließlich wurden Neurosphären instrumental im Down Studium und Hochregulation der Expression von kodierenden Genen oder kleine nicht-kodierenden RNAs 11, um ihre Rollen bei der Proliferation und Differenzierung von Zebrabärbling neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen zu untersuchen.
Zebrabärbling primären Neurosphären kann nach mehreren Passagen selbst zu erneuern. Zur Neurosphären bei Passage 1 und 2 zu erzeugen, die Schritte 5.1-5.4 wurden zweimal wiederholt, in insgesamt 6-8 Tage. Von DiV2-4 stieg die Größe der Neurosphären bis zu etwa 50 & mgr; m im Durchmesser. Sekundär- und Tertiärneurosphären wurden auch nach Passage 1 bzw. 2 (2D) erhalten. Bei Passage 3 waren Zebrabärbling Neurosphären jedoch nicht in der Lage bei der kritischen Größe von 50 & mgr; m Durchmesser zu wachsen und es versäumt , sich selbst zu erneuern, was darauf hindeutet , dass unsere Kultur Zustand wählt eher einen Pool von Stammzellen / Vorläuferzellen als eine reine Population von neuralen Stammzellen 4 .
Neurosphere Differenzierung
Neurosphären primären, sekundären oder tertiären abgeleitet entweder von der whole Gehirn oder vom telencephalic, des Kleinhirns und tectal Bereich der Erwachsenen Zebrabärbling wurden für ihre Differenzierung Möglichkeiten getestet. Zwischen 1 und 3 Tagen in vitro in Differenzierungsbedingungen (DiVd1-DiVd3) wurde eine Monoschicht von anhaftenden Zellen beobachtet (3A, B). Wie in 3C veranschaulicht, bei DiVd4 waren axonalen artigen Vorsprünge sowie Glia - Zellen sichtbar und unterscheidbar durch Expression immunhistologische oder Gen - 11 analysiert, die Beurteilung , dass neurale Stammzellen / Vorläuferzellen differenziert haben. In ähnlicher Weise differenziert Neuronen und Gliazellen aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen , isoliert aus verschiedenen Hirngebieten (Figuren 3D, E).
Gene Expression Manipulation in Zebrabärblinge Neurosphären
Wir haben die Rolle von miR-107 auf der neuronalen und glialen Differenzierung von ganzen Zebrabärbling Gehirn-de getestet rived neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen (Abbildung 4). Wir zeigten , dass die Herunterregulierung von miR-107 durch anti-miR-107 nicht Neurosphärenbildung aber veränderte neuronale Differenzierung beeinflußte, wie durch das abnormale Wachstum von axonalen Prozessen angegeben (4A, B). RT-PCR Genexpressionsanalysen bestätigt, dass die Hemmung von miR-107 führt zu einer erhöhten Expression von sowohl der Neuroblasten Marker Neurogenin-1 (NGN-1) und Axon-spezifischer Moleküle, wie MAP-2 und α-Tubulin ohne glial beeinflussen Zellmarkerexpression (S-100, GFAP, Olig2) (4C). Entsprechend der Beurteilung der Verstärkungsfaktor von miR-107 Expression von miR-107-Mimetikum eine Abnahme von neuroblast- und Axon-spezifischer Marker - Expression (Abbildung 4D) induziert werden , dass, in vitro, miR-107 wirkt als Regulator neuronaler Differenzierung während Zebrabärbling neurogenesis 11.
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Abb . 1: Schematische Darstellung des Protokolls Schritte , um die Verfahren und die damit verbundenen Timing gehören die Zergliederung entweder das gesamte Gehirn oder die telencephalic, tectal und zerebellären Regionen des erwachsenen Zebrafischgehirn (A, B), der Erhalt einer Einzelzellsuspension (C ), die Erzeugung von schwimmenden Neurosphären (D) und der Differenzierung von Neurospheres (E).
Abbildung 2: Forming Zebrabärbling Brain-Derived Neurosphären. (A - C) Repräsentative Phasenkontrastaufnahmen von ganzen brain-derived primären floating Neurosphären an Tag 1 beobachtet (div1, A), Tag 3 (div3, B) und Tag 4 (DIV4, C). (D) Diagramm die relative Anzahl von ne darstellturospheres bei Passages 1 und 2 auf die Neurosphärennummer bei Passage verglichen 0. Nach Passage 2 verringerte Neurosphären Bildung drastisch. Maßstabsbalken: 25 & mgr; m.
. Abbildung 3: Differenzierung von Zebrabärbling Gehirn stamm Neurospheres (A - C, E) Phasenkontrastbilder von ganzen Gehirn stammende Neurosphären kultiviert in der Z-Differenzierungsmedium während 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) und 4 (C und D, DiVd4) Tage. (E) Dorsale Ansicht des gesamten Gehirns einer 12 Monate alten Tg (GFAP: DsRed) Zebrabärbling. Die Telenzephalon (Tel), Tectum (Tec) und des Kleinhirns (kWk) wurden seziert und wie gezeigt, gesammelt. (D) Bilder von DiVd4 abgeleiteten Neurosphären aus dem Tectum, Telenzephalon und des Kleinhirns bei Passage 0 (P0), 1 (P1) Und 2 (P2). Maßstabsbalken: 25 & mgr; m.
Abbildung 4:. Die Analyse der Neurosphären Sie ist durch MiR107 Manipulation (A) Phasenkontrastbilder zeigen Div4d Neurosphären bei DIV4 mit den angegebenen Oligonukleotiden behandelt. Schwarz-Boxen in den oberen Platten zeigen den Bereich, in den Bodenplatten vergrößert. (B) Top - Chart stellt die Quantifizierung der Anzahl von Neurosphären mit gebildet oder ohne miR107. Neurosphären sind durch ihre Größe (20-30 & mgr; m, 31 bis 50 & mgr; m,> 51 & mgr; m im Durchmesser) subgrouped. Untere Diagramm zeigt die Quantifizierung der axonale Projektionen von Neurosphären behandelt und sub wie oben gruppiert. (C, D) qRT-PCR - Expressionsanalyse der angegebenen Gene durch Div4d Neurosphären zuvor mit angegebenen Oligonucleotide auf DIV4 behandelt. Die Daten stellen denMittelwert ± SEM, * p <0,05, n = 3. Scr: Gerangel. Maßstabsbalken: 25 & mgr; m.
| Problem | Mögliche Ursache | Lösung |
| Wiederherstellung von zu vielen toten Zellen | Zeitverzögerung in das Gehirn vor enzymatische Behandlung vorbereitet | Stellen Sie sicher, dass die Dissektion einrichten und Medien bereit sind, bevor die Fische zu opfern (auch Sterilität überprüfen, Temperatur) |
| Strikte Papain Behandlung | Mechanische Dissoziation muss empfindlich genug sein, um eine Live-Einzelzellsuspension zu erzeugen, aber stark genug, um zu vermeiden, hinter sich zu lassen zu viele Klumpen von Gewebe. Beachten Sie die empfohlenen Zeiten und Temperaturen für die Inkubation / Zentrifugation Perioden | |
| Neurosphären erscheinen oder wachsen nicht schlecht | Falsche Temperatur | Überprüfen Sie, dass Inkubator bei 30 ° C, um die c ist die Bereitstellungie ordnungsgemäße Temperatur. |
| Wachsende Kugeln mit Schutt entfernt | Für jeden gut, hat das Streben von Schutt auf dem Medium gut durchgeführt werden. Vermeiden Sie in das Medium Eingabe mit Ihrem pipettieren | |
| Die Integrität einiger Reagenzien (B27 Ergänzung, EGF, FGF) geschwächt | Diese Integrität bildet begrenzenden Faktoren in Zellwachstum. Überprüfen Sie die Chargennummer und die Art und Weise wurden Proben erhalten. Vermeiden Sie auftauen / wieder einfrieren Zyklen jedes abgetastete Reagenz in Kultur verwendet | |
| Das Vorhandensein von Einzelzellen | Art der Übertragung / Expansion von Neurosphären ist zu hart | Dieser Schritt ist eine Erweiterung / Verdünnungsschritt, weil zu viele Kugeln in der Vertiefung gebildet. Vermeiden Sie harte Kugel Sammlung während der Übertragung Neurosphere Dissoziation in einzelne Zellen zu verhindern |
| Fehlen von Zellen auf Matrigel | Matrigel wurde nicht richtig aufgetaut / verwässert | Matrigel von -20 ° C benötigt mindestens 30 min bei 4 ° C auftauen und bleibt viskos Pipettieren vorsichtig |
| Keine Haftung auf Matrigel | Das Volumen der Zellsuspension besitzt klein genug sein, Zellablagerung auf Matrigel coat zu ermöglichen | |
| Erlauben, mehr Zeit für die Zellabscheidung (bis zu 2 h, wenn größere Mengen verwendet werden) | ||
| Frische Differenzierungsmedium zu kalt | Wenn die Zelle-Befestigungsmedium ersetzen, muss das Differenzierungsmedium bei 30 ° C aufgewärmt werden Thermoschock auf den abgeschiedenen Zellen zu verhindern | |
| Schlechte Nukleofektion | Tote Zellen | Stellen Sie sicher, dass Sie keine Luftblasen erzeugen, während Nukleofektion durchführen. Verwenden Sie qualitativ hochwertige DNA-Vektoren durch Maxi-Präparate verwenden. Mindestens 1 bis 2 Stunden nach der Nukleofektion, ersetzen Kulturmedium entweder frisch Z-Differenzierung Zustand Medium oder Z-Zustand Medium. |
| Nur wenige positive Neurosphären | Neurosphären unterschiedlicher Größe kann zu schlechter Nukleofektion führen. Mit Neurosphären bei div2 und div3 sind ideal für Nukleofektion. Zelldichte sollte nicht mehr als 4 x 10 3 Neurospheres ml -1 in einem 100 ml Reaktions. |
Tabelle 1: Fehlerbehebung Beratung Listing, für jeden Schritt des Protokolls möglichen Probleme und die Lösungen sie zu überwinden.
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Discussion
Das Hauptziel dieses Protokoll ist zur Isolierung und Kultur adult Zebrabärbling Gehirn stammNeuroSphären für die zellulären und molekularen Eigenschaften von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen zu studieren. Hier berichten wir , wie multipotenten neuralen Zellen auszuwählen und erzeugen die drei neuronalen Zelltypen, das heißt, Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozyten, vom erwachsenen Zebrafischgehirn. Das Protokoll ist sehr bedeutsam, da eine reproduzierbare Neurosphäre bildenden Assays bislang nicht in der Zebrabärbling etabliert worden war.
Einige wichtige Schritte in dem Protokoll müssen respektiert werden und wurden in der zur Fehlerbehebung (Tabelle 1) recapitutaled worden. Zunächst tritt Zelltod sowohl während der Präparation des erwachsenen Zebrafischgehirn und die Einzelzellsuspension Verfahren. Zur Begrenzung der von Zelltod verlängern, ist es wichtig, sauber und scharfe Werkzeuge zu verwenden, sowie zur strikten Beachtung der Zeitpunkt und die Temperatur der Inkubation in der vorliegenden Pro empfohlen respektierenkoll. Zweitens sollte Neurosphere Kultur mit frisch zubereiteten Medien und mit einer sorgfältigen Pipettiertechnik durchgeführt werden. Drittens Zelldichte Empfehlungen sollen eine zuverlässige Verlängerung oder Differenzierung von Neurosphären-Zellen zu erhalten, folgen. In diesem Sinne sollte jeder Fachzellkulturtechniken der Lage sein, das Protokoll zu verwenden und die Isolation durchzuführen, Kultur und Genmanipulation von erwachsenen Zebrabärbling brain-derived Neurosphären.
Die Kügelchenbildungsassays in der Zebrabärbling wird aus den gleichen Beschränkungen leiden in Säugerarten zuvor beschriebenen 4: 1) das Verhalten von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen nach ihrer Isolation aus ihrer natürlichen Gehirn Nische verändert wird; 2) Neurosphären sind keine homogene Population von Stammzellen, sondern umfassen Stammzellen, Vorläuferzellen sowie post-mitotischen differenzierten Zellen. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass unser Protokoll aclonal Neurosphere Kulturen erzeugt. Die Zelldichte von Kulturenein kritischer Parameter in Kügelchenbildungsassays , da sie bestimmt , Klonalität, dh ob die Kultur klonalen, semi-klonaler oder aclonal ist. Klonale Bedingungen erlauben, genau zu charakterisieren und die verschiedenen Pools von Stamm- und Vorläuferzellen in Kultur zu quantifizieren. Wir haben nicht in der Lage gewesen Zelle Klonalität Assays durchzuführen, so weit und unsere Kulturbedingungen müssen noch mehr Optimierung, bevor wir neuralen Stammzellen aus anderen Vorläuferzellpools unterscheiden kann.
Zebrabärbling Neurosphere Kulturen können für eine Vielzahl von Experimenten verwendet werden. Sie erlauben die Expression Genanalyse sowie Manipulation der Genexpression während der Neurogenese , wie durch unsere Studie zur Bewertung miR-107 - Funktion in der gewebsspezifische Bestimmung von neuralen Zellschicksal (4 und 11). Zusätzliche Anwendungen umfassen Genom Bearbeitungsstrategien, wie beispielsweise die CRISPR / Cas9 System, um die Rolle von neuralen Stammzellen / Vorläufergene in neuroge zu testennesis und Gehirn Reparatur 13. Schließlich zeigt unser Protokoll , dass Zebrabärblinge Neurosphären können aus verschiedenen Hirnregionen schaffen die Möglichkeit ableiten regionsspezifische Merkmale von Neuronen und Gliazellen zu studieren und die zellulären und molekularen Basis neuronaler Zell Heterogenität in verschiedenen ventrikuläre Domänen des cerebra- 14 zu erkunden .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
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