Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
Filamenteuse-actine joue un rôle crucial dans la majorité des processus cellulaires, y compris la motilité et, dans les cellules immunitaires, la formation d'une interaction cellule-cellule clé connue sous le nom de la synapse immunologique. F-actine est également supposé jouer un rôle dans la régulation des distributions moléculaires à la membrane des cellules, y compris la dynamique de vésicules sous-membraneuse et le regroupement des protéines. Bien que les techniques de microscope optique standard permettent observations généralisées et limitée par la diffraction à faire, de nombreux événements cellulaires et moléculaires, y compris le regroupement et le flux moléculaire se produisent dans les populations à longueur des échelles bien en dessous du pouvoir de résolution de la microscopie optique standard. En combinant totale fluorescence par réflexion interne à la résolution d'imagerie procédé illumination structurée ultra microscopie, l'écoulement moléculaire à deux dimensions de la F-actine à la synapse immunitaire des cellules T a été notée. Spatio-temporelle spectroscopie de corrélation d'images (STICS) a ensuite été appliqué, ce qui génère resul quantifiablets sous la forme d'histogrammes de vitesse et des cartes vectorielles représentant directionnalité de l'écoulement et de l'ampleur. Ce protocole décrit la combinaison de l'imagerie et STICS techniques de super-résolution pour générer des vecteurs d'écoulement au niveau de détail sous-diffraction. Cette technique a été utilisée pour confirmer un flux d'actine qui est symétrique centripète rétrograde et tout au long de la périphérie des cellules T lors de la formation de la synapse.
Introduction
Le but de l'expérience est à l'image et de caractériser le flux moléculaire de filamentous- (F-) actine dans les cellules vivantes T, au-delà de la limite de diffraction afin d'établir le sens d'écoulement et de l'ampleur au cours synapse immunologique (IS) de la formation. Cette technique sera réalisée à l'aide d'un microscope à éclairage structurée (SIM) en mode fluorescence totale de réflexion interne (TIRF), l'imagerie de cellules T Jurkat qui font synapse artificielle sur l'activation des lamelles revêtues d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3. Les formes se situe entre un lymphocyte T et sa cible; une cellule présentatrice d'antigène (APC) à l'récepteur des cellules T (TCR) 1,2 d'activation. Comme cela est la première étape pour déterminer si le système immunitaire adaptatif génère une réponse immunitaire à une infection, les conséquences de la réactivité aux stimuli incorrecte peut provoquer un certain nombre de maladies. L'importance de l'interaction des cellules T-APC est bien documentée, cependant, le rôle (s) de l'adulte est après si TCR initialeinternalisation gnal sont pas encore pleinement compris.
Comme le cytosquelette est pensé pour aider deux processus liés à l'activation du TCR (le mouvement des molécules à la membrane plasmique et le contrôle des molécules dépendant du cytosquelette d'actine 3,4 signalisation), de comprendre comment le cytosquelette réorganise spatialement et temporellement feront bien comprendre les étapes de la réorganisation moléculaire pendant la formation de la synapse. Le flux rétrograde de F-actine est pensé pour corral grappes TCR vers le centre de la synapse immunologique, cette translocation est considéré comme vital pour la cessation du signal et le recyclage; aidant l'équilibre délicat de l'activation des cellules T 5.
Bien que la microscopie à fluorescence standard est un outil flexible qui continue de donner un aperçu sur de nombreux événements biologiques y compris les interactions cellule-cellule, elle est limitée par la capacité du système pour résoudre avec précision de multiples fluorophores résidant plus près que la Diffrlimite d'action (≈200 nm) de l'autre. Comme de nombreux événements moléculaires dans les cellules impliquent des populations denses de molécules et présentent réarrangement dynamique soit en repos ou lors de la stimulation spécifique, la microscopie optique conventionnelle ne fournit pas une image complète.
L'utilisation de l'imagerie super-résolution a permis aux chercheurs de contourner la limite de diffraction en utilisant une variété de techniques. Seule molécule localisation microscopie (SMLM) tels que PALM et STORM 6,7 a la capacité de résoudre l'emplacement de molécules jusqu'à une précision de l'ordre de 20 nm, cependant, ces techniques reposent sur des temps d'acquisition longues, construire une image sur plusieurs cadres . En général, cela nécessite des échantillons à être fixes ou pour les structures à faible mobilité présentent fluorophores si simples ne sont pas interprété comme de multiples points. Alors que l'épuisement de l'émission stimulée (STED) imagerie permet de super-résolution par le biais très sélectif confocale excitation 8, le balayage nécessaireapproche peut être lente sur des champs entiers de cellules de vue. STED démontre également phototoxicité important pour des résolutions plus élevées en raison de l'augmentation de la puissance du faisceau d'épuisement.
Structuré microscopie éclairage (SIM 9) offre une alternative à ces méthodes, capables de doubler la résolution d'un microscope à fluorescence standard et est plus compatible avec l'imagerie des cellules vivantes que les techniques de SMLM actuelles. Il utilise des puissances inférieures laser, sur un système à grand champ pour les champs de cellules entières de vue; Fournir davantage des vitesses d'acquisition, et est compatible avec l'étiquetage fluorophore standard. La nature à grand champ de la carte SIM permet également l'utilisation de la fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) pour l'excitation hautement sélectif, avec des profondeurs de pénétration dans la dimension axiale de <100 nm.
Spectroscopie de corrélation d'images (ICS) est une méthode de corrélation des fluctuations d'intensité de fluorescence. Une évolution de ICS; Im spatio-temporelleâge spectroscopie de corrélation (STICS 10) corrèle signaux fluorescents intracellulaires dans le temps et l'espace. En corrélant intensités de pixels entourant les pixels de retard dans des trames par l'intermédiaire d'une fonction de corrélation, l'information est acquise en ce qui concerne les vitesses d'écoulement et de directivité. Pour assurer objets statiques ne pas interférer avec l'analyse STICS, un filtre d'objet immobile est mis en œuvre, qui travaille en soustrayant une moyenne mobile des intensités des pixels.
La technique présentée ici est considérée comme étant la première démonstration de la spectroscopie de corrélation d'image étant appliqué à des données de microscopie super-résolution pour quantifier le flux moléculaire dans 11 des cellules vivantes. Cette méthode améliore l'imagerie par diffraction limitée des flux F-actine via une analyse STICS 12 et conviendrait chercheurs qui souhaitent déterminer le flux moléculaire en deux dimensions dans les cellules vivantes, à partir de données acquises à des résolutions spatiales au-delà de la limite de diffraction de la lumière.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette technique permettra aux chercheurs de l'image et de quantifier les détails précédemment insolubles dans les cellules exprimant la fluorescence. Dans nos résultats, nous montrons que la F-actine des flux d'une manière symétrique à partir de la périphérie de la cellule vers le centre de la cellule dans la cellule T est. Ces résultats sont cohérents avec les résultats antérieurs de la ligne 1D données de profil kymographe 13 et étendent la capacité d'analyse de données 2D et de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
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