Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
Filamenteus actine speelt een cruciale rol in de meeste celprocessen zoals motiliteit en in immuuncellen, de vorming van een belangrijke cel-cel interactie bekend als immunologische synaps. F-actine ook gespeculeerd een rol spelen bij het reguleren moleculaire verdelingen in de membraan van cellen inclusief sub-membraneuze blaasjes dynamiek en eiwit clustering. Terwijl de standaard lichtmicroscoop technieken maken algemene en buigingsbegrensd waarnemingen worden gedaan, vele cellulaire en moleculaire gebeurtenissen zoals clustering en moleculaire stroom optreden in populaties in lengte-schalen ver onder het oplossend vermogen van standaard lichtmicroscopie. Door het combineren van totale interne reflectie fluorescentie met superresolutie beeldvormingswerkwijze gestructureerde verlichting microscopie, de tweedimensionale moleculaire stroom F-actine bij de immune synaps van T-cellen opgenomen. Tijdruimtelijke afbeelding correlatie spectroscopie (Stokjes) werd vervolgens toegepast, waarbij meetbare resul genereertts in de vorm van snelheid histogrammen en vector kaarten die stroom richting en omvang. Dit protocol beschrijft de combinatie van super-resolutie beeldvorming en Stokjes technieken om stroom vectoren op sub-diffractie niveau van detail te genereren. Deze techniek werd gebruikt om een actine stroom die symmetrisch retrograde en centripetale gehele omtrek van T-cellen na synapsvorming bevestigen.
Introduction
Het doel van het experiment is het beeld en karakteriseren van de moleculaire stroom filamentous- (F-) actine in levende T-cellen, dan de diffractielimiet om stromingsrichting en de omvang vast tijdens immunologische synapsen (IS) formatie. Deze techniek wordt uitgevoerd met een gestructureerde belichting microscoop (SIM) in de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) modus beeldvorming Jurkat T-cellen die een kunstmatige synaps het activeren dekglaasjes bekleed met anti-CD3 en anti-CD28-antilichamen. De IS vormen tussen een T-cel en zijn doel; een antigeen presenterende cel (APC) van T-celreceptor (TCR) activatie 1,2. Aangezien dit de eerste stap bij het bepalen of het adaptieve immuunsysteem genereert een immuunreactie op een infectie, kunnen de gevolgen van onjuiste respons op stimuli een aantal ziekten. Het belang van de T-cel-APC interactie goed gedocumenteerd, maar de rol (len) van het rijpe IS na de eerste TCR signaal internalisatie zijn nog niet volledig begrepen.
Aangezien het cytoskelet wordt gedacht dat twee processen verbonden TCR activering (beweging van de moleculen aan het plasmamembraan en de controle van signaalmoleculen afhankelijk van het actine cytoskelet 3,4), begrijpen hoe het cytoskelet herschikt ruimtelijk en temporeel steun de stappen verhelderen moleculaire reorganisatie gedurende synapsvorming. De retrograde stroom F-actine wordt gedacht dat TCR clusters kraal naar het midden van de immunologische synaps wordt deze translocatie verondersteld essentieel voor signaal beëindiging en recycling worden; helpen de fijne balans van T-celactivering 5.
Terwijl de standaard fluorescentie microscopie is een flexibel instrument dat blijft inzicht over de vele evenementen, waaronder biologische cel-cel interacties, wordt beperkt door het vermogen van het systeem om nauwkeurig te lossen meerdere fluoroforen woonachtig dichterbij dan de diffractielimiet (≈200 nm) van elkaar. Zoveel moleculaire gebeurtenissen in cellen betrekken dichte populaties van moleculen en vertonen dynamische omlegging hetzij in rust of bij specifieke stimulatie, maakt conventionele lichtmicroscopie geen volledig beeld.
Het gebruik van superresolutie beeldvorming heeft toegestaan onderzoekers om de diffractielimiet behulp van een verscheidenheid aan technieken te omzeilen. Enkel molecuul lokalisatie microscopie (SMLM) zoals PALM en STORM 6,7 heeft de mogelijkheid om de locatie van moleculen opgelost tot een nauwkeurigheid van ongeveer 20 nm, maar deze technieken afhankelijk langere opnametijden, opbouw van een beeld op vele frames . In het algemeen vereist dit monsters vast te stellen of voor structuren om lage mobiliteit vertonen dus enkele fluoroforen worden niet geïnterpreteerd als meerdere punten. Terwijl de gestimuleerde emissie uitputting (STED) beeldvorming maakt super-resolutie door zeer selectieve confocale excitatie 8, de vereiste scannenbenadering kan langzaam over heel cel gezichtsvelden zijn. STED toont ook significant fototoxiciteit hogere resoluties vanwege de vermogenstoename van de uitputting bundel.
Gestructureerde verlichting microscopie (SIM 9) biedt een alternatief voor deze methoden, die in staat van een verdubbeling van de resolutie van een standaard fluorescentie microscoop en is compatibel met live cell imaging dan de huidige SMLM technieken. Het maakt gebruik van lagere laser bevoegdheden, op een breed veld voor whole-cell gezichtsvelden; Sterkere overname snelheden, en is compatibel met standaard fluorofoor etikettering. De breedveldbeeld karakter van SIM maakt ook het gebruik van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) voor zeer selectieve excitatie met indringdiepten in de axiale afmeting van <100 nm.
Afbeelding correlatie spectroscopie (ICS) is een methode correleren fluctuaties in fluorescentie-intensiteit. Een evolutie van ICS; Tijdruimtelijke imleeftijd correlatie spectroscopie (Stokjes 10) correleert intracellulaire fluorescerende signalen in tijd en ruimte. Door het correleren pixelintensiteiten met de omliggende pixels in achterblijvende frames via een correlatie functie, wordt informatie verkregen over stroomsnelheden en richting. Om ervoor statische objecten niet interfereren met de Stokjes analyse wordt een onbeweeglijk object filter toegepast, die werkt door het aftrekken van een voortschrijdend gemiddelde van de pixelintensiteiten.
De hier gepresenteerde techniek wordt als de eerste demonstratie van beeldcorrelatie spectroscopie toegepast op microscopie data superresolutie de moleculaire stroming in levende cellen 11 kwantificeren. Deze methode verbetert buigingsbegrensd beeldvorming van F-actine stroom via Stokjes analyse 12 en zou onderzoekers die willen bepalen tweedimensionale moleculaire stroming in levende cellen, uit gegevens verkregen bij ruimtelijke resoluties dan de diffractie limiet van het licht aan te passen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze techniek zal de onderzoekers om de afbeelding toe te staan en te kwantificeren eerder onoplosbare informatie in cellen die fluorescentie. In onze resultaten laten we zien dat F-actine stromen op symmetrische wijze uit de cel periferie naar het centrum van de cel T-cel IS. Deze bevindingen komen overeen met eerdere resultaten uit 1D lijnprofiel kymograaf data 13 en de capaciteit van de analyse uit te breiden naar 2D en super-resolutie data.
De gepresenteerde techniek is …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
