Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
-Actina filamentosa desempenha um papel crucial na maioria dos processos celulares, incluindo a motilidade e, em células do sistema imunológico, a formação de uma interacção célula-célula chave conhecida como a sinapse imunológica. F-actina também é especulado para desempenhar um papel na regulação da distribuição molecular na membrana de células, incluindo vesículas dinâmica sub-membranoso e agrupamento da proteína. Embora as técnicas de microscopia de luz padrão permitem observações generalizadas e limitou-difração de ser feita, muitos eventos celulares e moleculares, incluindo clustering e fluxo molecular ocorrem em populações de comprimento escalas muito abaixo do poder de resolução da microscopia de luz padrão. Através da combinação total de fluorescência de reflexão interna com o método de iluminação estruturada microscopia de super-resolução de imagem, o fluxo molecular bidimensional da actina F na sinapse imune das células T foi gravado. Espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal (STICS) foi então aplicada, o que gera resul quantificávelts na forma de histogramas de velocidade e mapas vetoriais que representam a direcionalidade e fluxo magnitude. Este protocolo descreve a combinação de técnicas de imagem e os paus de super-resolução para gerar vetores de fluxo em níveis sub-difração de detalhe. Esta técnica foi utilizada para confirmar uma fluxo de actina que é simetricamente retrógrada e centrípeta ao longo da periferia de células T mediante a formação de sinapses.
Introduction
O objectivo da experiência é a imagem e caracterizar o fluxo molecular de filamentous- (F-) actina em células T vivo, para além do limite de difracção, a fim de estabelecer a direcção do fluxo e durante a magnitude sinapse imunológica (IS) formação. Esta técnica irá ser realizada utilizando um microscópio de iluminação estruturada (SIM) no modo de reflexão interna total de fluorescência (TIRF), imagiologia de células T de Jurkat que formam uma sinapse artificial sobre a activação das lamelas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28. Os formulários está entre uma célula T e seu alvo; uma célula que apresenta antigénios (APC) em cima do receptor de células T (TCR) 1,2 activação. Como esta é a primeira etapa para determinar se o sistema imunitário adaptativo gera uma resposta imunitária a uma infecção, as consequências da capacidade de resposta a estímulos incorrecta pode provocar um certo número de doenças. A importância da interacção de células T-APC está bem documentada, no entanto, o papel (s) do maduro é depois Si TCR inicialinternalização nal ainda estão para ser totalmente compreendido.
Como o citoesqueleto é pensado para auxiliar dois processos ligados à activação de TCR (o movimento de moléculas na membrana plasmática e do controlo de moléculas de sinalização dependentes do citoesqueleto de actina 3,4), compreender como o citoesqueleto reorganiza espacial e temporalmente irá elucidar os passos de reorganização molecular durante a formação de sinapses. O fluxo retrógrado de F-actina é pensado para encurralar aglomerados de TCR em direcção ao centro da sinapse imunológica, esta translocação se acredita ser fundamental para a cessação do sinal e de reciclagem; auxiliando o bom equilíbrio de activação de células T 5.
Enquanto a microscopia de fluorescência padrão é uma ferramenta flexível que continua a fornecer uma visão sobre muitos eventos biológicos, incluindo interações célula-célula, ela é limitada pela capacidade do sistema para resolver com precisão vários fluoróforos que residem mais perto do que o diffrlimite de acção (≈200 nm) de cada outro. Como muitos eventos moleculares dentro das células envolvem densas populações de moléculas e apresentam rearranjo dinâmico quer na quietude ou mediante estimulação específica, microscopia de luz convencional não fornece a imagem completa.
A utilização de super-resolução de imagem permitiu a investigadores para contornar o limite de difracção utilizando uma variedade de técnicas. Microscopia molécula única localização (SMLM), tais como PALM e STORM 6,7 tem a capacidade de resolver o local de moléculas até uma precisão de cerca de 20 nm, no entanto, estas técnicas dependem de longos tempos de aquisição, a criação de uma imagem ao longo de muitos quadros . Geralmente isso requer amostras a serem fixos ou para estruturas mostrou baixa mobilidade fluorophores tão simples não são mal interpretados como vários pontos. Enquanto esgotamento emissão estimulada (STED) imagiologia permite super-resolução através da excitação confocal muito seletivo 8, a digitalização necessáriaabordagem pode ser lento sobre os campos de células inteiras de vista. STED também demonstra fototoxicidade significativo para resoluções mais elevadas devido ao aumento do poder do feixe de esgotamento.
Microscopia de iluminação estruturada (SIM 9) proporciona uma alternativa a estes métodos, capazes de duplicar a resolução de um microscópio de fluorescência padrão e é mais compatível com a imagem de células vivas do que as técnicas correntes SMLM. Ele usa poderes de laser inferiores, em um sistema de campo amplo para campos de células inteiras de vista; proporcionando maior velocidade de aquisição, e é compatível com rotulagem fluoróforo padrão. A natureza de campo amplo de SIM também permite a utilização de fluorescência total interno de reflexão (TIRF) para excitação altamente seletivo, com profundidades de penetração na dimensão axial de <100 nm.
Espectroscopia de correlação de imagem (ICS) é um método de correlacionar as flutuações na intensidade de fluorescência. Uma evolução do ICS; Im espaço-temporalespectroscopia de correlação de idade (STICS 10) correlaciona sinais fluorescentes intracelulares no tempo e no espaço. Ao correlacionar intensidades de pixel com áreas pixels em quadros mais atrasadas através de uma função de correlação, a informação é adquirida com as velocidades de fluxo e direcionalidade. Para garantir objectos estáticos não interfiram com a análise STICS, um filtro objecto imóvel é implementado, o qual funciona através da subtracção de uma média móvel da intensidade dos pixels.
A técnica aqui apresentada acredita-se ser a primeira demonstração de espectroscopia de correlação de imagem a ser aplicada aos dados de microscopia de super-resolução para quantificar o fluxo molecular em células vivas 11. Este método melhora na imagem limitado por difração de fluxo de F-actina via análise STICS 12 e serviria para pesquisadores que desejam determinar o fluxo molecular bidimensional em células vivas, a partir de dados adquiridos em resoluções espaciais para além do limite de difração da luz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica permitirá aos investigadores a imagem e quantificar previamente detalhes insolúveis em células que expressam fluorescência. Nos nossos resultados que mostram que os fluxos de F-actina de um modo simétrico a partir da periferia em direcção ao centro da célula a célula na célula T IS. Estes resultados são consistentes com os resultados anteriores de dados de perfil quimógrafo linha 1D 13 e ampliar a capacidade de análise de dados 2D e super-resolução.
A …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
