Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
Filamentösen -Actin spielt eine entscheidende Rolle bei der Mehrheit der Zellprozesse einschließlich Motilität und in Immunzellen, die Bildung eines Schlüssels Zell-Zell-Interaktion als der immunologischen Synapse bekannt. F-Actin ist auch spekuliert, eine Rolle bei der Regulierung des Molekular Verteilungen auf der Membran von Zellen einschließlich der Unter membranöse Vesikel Dynamik und Protein Clustering spielen. Während Standard-Lichtmikroskop-Techniken ermöglichen verallgemeinert und beugungsbegrenzte Beobachtungen gemacht werden, treten viele zellulären und molekularen Ereignisse, einschließlich Clusterbildung und molekulare Strömung in der Bevölkerung auf Längenskalen weit unter dem Auflösungsvermögen des Standard-Lichtmikroskopie. Durch die Kombination interner Totalreflexion Fluoreszenz mit dem Superauflösungsabbildungsverfahren strukturierten Beleuchtung Mikroskopie wurde die zweidimensionale molekulare Strömung von F-Aktin an der Immun Synapse von T-Zellen aufgezeichnet. Räumlich-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie (stics), wurde dann angewendet, die quantifizierbar Resul erzeugtts in Form von Geschwindigkeits Histogramme und Vektorkarten, die Strömungsrichtungs und Größenordnung. Dieses Protokoll beschreibt die Kombination von superauflösenden Abbildung und STICs Techniken zur Strömungsvektoren an Unterbeugungsdetailniveaus zu erzeugen. Diese Technik wurde verwendet, um ein Aktin-Strömung, die symmetrisch ist und retrograde zentripetalen der gesamten Peripherie der T-Zellen bei der Synapsenbildung zu bestätigen.
Introduction
Das Ziel des Experiments ist es, Bild und Charakterisierung der molekularen Strömung von filamentous- (F-) Aktin in lebenden T-Zellen, jenseits der Beugungsgrenze, um die Strömungsrichtung und die Größe bei immunologischen Synapse (IS) Bildung zu etablieren. Diese Technik wird unter Verwendung einer strukturierten Beleuchtung Mikroskop (SIM) in Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF)-Modus durchgeführt werden, die Abbildung Jurkat T-Zellen bilden eine künstliche Synapse zur Aktivierung Deckgläser mit Anti-CD3- und anti-CD28-Antikörper beschichtet. Der IS Formen zwischen einer T-Zelle und dessen Ziel; eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) bei der T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierungs 1,2. Da dies der erste Schritt bei der Bestimmung, ob das adaptive Immunsystem eine Immunantwort auf eine Infektion, können die Folgen von Fehl auf Stimuli an einer Reihe von Krankheiten verursachen. Die Bedeutung der T-Zell-APC-Wechselwirkung ist gut dokumentiert, jedoch die Rolle (n) des reifen nach dem erstmaligen TCR signal Internalisierung sind noch nicht vollständig verstanden werden.
Wie das Zytoskelett wird angenommen, dass zwei Prozesse zur TCR-Aktivierung (die Bewegung von Molekülen in der Plasmamembran und die Steuerung der Signalmoleküle abhängig Aktinzytoskeletts 3,4), zu verstehen, wie das Zytoskelett umlagert räumlich und zeitlich verknüpft unterstützen wird die Schritte erläutern molekularer Reorganisation während der Synapsenbildung. Die retrograde Strom von F-Aktin ist gedacht, um TCR-Cluster in Richtung der Mitte der immunologischen Synapse Koppel, wird diese Translokation angenommen Vitalsignal Aufhören und Recycling zu sein; Hilfe für die feine Balance der T-Zellaktivierung 5.
Während Standard-Fluoreszenzmikroskopie ist ein flexibles Werkzeug, um einen Einblick zu vielen biologischen Ereignisse, einschließlich Zell-Zell-Interaktionen bieten weiterhin, wird es durch die Fähigkeit des Systems, mehrere Fluorophore genau aufzulösen Wohnsitz näher als die diffr begrenztAktionsgrenze (≈200 nm) voneinander. Wie viele molekularen Ereignisse innerhalb von Zellen beinhalten dichten Populationen von Molekülen und weisen dynamische Umlagerung entweder in Ruhe oder auf ausdrückliche Anregung, keine konventionellen Lichtmikroskopie nicht die vollständige Bild.
Die Verwendung von Super Resolution Imaging konnten Forscher die Beugungsgrenze unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken zu umgehen. Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) wie PALM und STORM 6,7 hat die Fähigkeit, die Position von Molekülen bis zu einer Genauigkeit von etwa 20 nm zu beheben, aber diese Techniken beruhen auf langen Erfassungszeiten, den Aufbau eines Bildes über viele Frames . Im Allgemeinen erfordert diese Proben fest oder für die Strukturen, die geringe Mobilität aufweisen, so einzelne Fluorophore nicht als mehrere Punkte fehlinterpretiert. Während Stimulated Emission Depletion (STED) Bildgebung ermöglicht Super-Resolution durch sehr selektiv konfokale Anregungs 8, die erforderliche ScanAnsatz kann über die ganze Zellfelder langsam sein. STED zeigt auch signifikante Photo hohen Auflösung aufgrund der Erhöhung der Leistung des Verarmungsstrahls.
Strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM 9) stellt eine Alternative zu diesen Verfahren in der Lage, die Verdoppelung der Auflösung eines Standard-Fluoreszenzmikroskop und ist mit Live Cell Imaging ist als aktuelle SMLM Techniken kompatibel. Es nutzt niedrigere Laserleistungen, auf einem Weitfeldsystem für Ganzzellfelder; Versehen erhöhten Akquisitionsgeschwindigkeiten und ist mit Standard-Fluorophor Kennzeichnung kompatibel. Die Weitfeld Natur der SIM gestattet auch die Verwendung von interner Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) für hochselektive Anregung mit Eindringtiefen in axialer Durchmesser von <100 nm.
Bildkorrelationsspektroskopie (ICS) ist ein Verfahren zum Korrelieren von Fluktuationen der Fluoreszenzintensität. Eine Weiterentwicklung des ICS; Raum-Zeit-imAlter Korrelationsspektroskopie (STICs 10) korreliert intrazellulären Fluoreszenzsignale in Zeit und Raum. Durch die Korrelation Pixelintensitäten mit umgebenden Pixeln in rückständigen Rahmen über eine Korrelationsfunktion wird Informationen über Strömungsgeschwindigkeiten und Direktionalität gewonnen. Um sicherzustellen, statische Objekte nicht mit dem STICs Analyse stören, ist ein unbewegliches Objekt-Filter implementiert, das durch Subtrahieren des gleitenden Durchschnitts der Pixelintensitäten funktioniert.
Die hier vorgestellte Technik wird angenommen, dass die erste Demonstration von Bildkorrelationsspektroskopie an superauflösende Mikroskopie Daten angewendet, um die molekulare Strömung in lebenden Zellen 11 quantifizieren. Dieses Verfahren verbessert beugungsbegrenzte Abbildung von F-Actin Fluss über STICs Analyse 12 und würde Forschern, die zweidimensionale molekulare Strömung in lebenden Zellen zu bestimmen, von der bei räumlichen Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze von Licht erfaßten Daten Wunsch zu entsprechen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Technik wird Forschern, die dem Bild zu ermöglichen und zu quantifizieren, bisher nicht auflösbaren Details in Zellen Fluoreszenz exprimieren. In unseren Ergebnissen zeigen wir, dass F-Actin fließt in einer symmetrischen Art und Weise aus der Zellperipherie in Richtung der Zellzentrum in der T-Zelle. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Ergebnissen von 1D Linienprofil kymograph Daten 13 und erstrecken sich die Kapazität der Analyse, um 2D- und Super-Resolution-Daten.
D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
