Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
İpliksi-aktin motilite ve bağışıklık hücrelerinde, immünolojik sinaps olarak bilinen önemli bir hücre-hücre etkileşim oluşumu dahil hücre işlemlerinin çoğunda önemli bir rol oynar. F-aktin, aynı zamanda, alt-membranöz vezikül dinamikleri ve protein kümelenme de dahil olmak üzere hücre zarı moleküler dağılımlarının düzenlenmesinde bir rol oynadığı düşünülmektedir. Standart ışık mikroskobu teknikleri genelleştirilmiş ve kırınım sınırlı gözlemler yapılmasına izin verirken, kümeleme ve moleküler akış dahil olmak üzere birçok hücresel ve moleküler olayların çok standart ışık mikroskobu çözme gücü altında uzunluk-ölçeklerde toplumlarda görülür. Süper çözünürlük görüntüleme yöntemi yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ile toplam iç yansıma floresan birleştirerek, T hücrelerinin bağışıklık sinaps F-aktin iki boyutlu moleküler akış kaydedildi. Ölçülebilir resul üretir uzay-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi (ampüller) daha sonra uygulandı,hız histogramlar ve akış yönünü ve büyüklüğünü temsil eden vektör haritaları şeklinde ts. Bu protokol detay alt kırınım seviyelerinde akış vektörleri oluşturmak için süper çözünürlüklü görüntüleme ve ampüller teknikleri kombinasyonunu açıklar. Bu teknik, sinaps formasyonu üzerine T hücrelerinin çevresi boyunca aktin simetrik retrograd akış ve merkeze doğru teyit etmek için kullanıldı.
Introduction
Bu deneyin amacı görüntü ve imünolojik sinapsın (IS) formasyonu sırasında akış yönünü ve büyüklüğünü tespit etmek için kırılma sınırının ötesine, T hücreleri canlı filamentous- (F), aktin moleküler akışını karakterize eder. Bu teknik anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile kaplı lamelleri aktive yapay bir sinaps meydana Jurkat T-hücreleri görüntüleme, toplam iç yansıma flüoresans (TIRF) modunda yapısal bir aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak yürütülecektir. Bir T hücresi ve hedef arasındaki IS formları; T hücresi reseptörü (TCR) aktivasyon 1,2 üzerine, bir antijen sunan hücre (APC). Bu adaptif immün sistemi, bir enfeksiyon, bir bağışıklık cevabı üretir belirleyen ilk adım olarak, uyaranlara yanıt doğru sonuçları bir dizi hastalığın neden olabilir. T hücre-APC etkileşiminin önemini iyi belgelenmiş, ancak, Olgun rolü (ler) ilk TCR si sonra ISgnal içselleştirme henüz tam olarak anlaşılmalıdır.
Hücre iskeleti adımları aydınlatmak olacak geçici TCR aktivasyonu (plazma membranında moleküllerin hareket ve 3,4 hücre iskeletinin aktin bağımlı sinyal molekülleri kontrol), hücre iskeleti mekansal yeniden düzenler nasıl anlamak bağlantılı iki süreç yardım ve düşünülüyor gibi sinaps oluşumu sırasında moleküler yeniden yapılanma. F-aktin retrograd akım immünolojik sinaps merkezine doğru TCR kümeleri ağıl düşünülmektedir, bu translokasyon sinyal kesilmesi ve geri dönüşüm için hayati olduğuna inanılmaktadır; T hücre aktivasyonu 5 ince bir denge yardım.
Standart floresan mikroskopi hücre-hücre etkileşimleri de dahil olmak üzere birçok biyolojik olaylar hakkında fikir vermeye devam etmektedir esnek bir araç olsa da, doğru bir diffr daha yakın ikamet eden birden fazla fluorophores çözmek için sistemin yeteneği ile sınırlıdırbirbirinden işlem sınırı (≈200 nm). Hücre içinde birçok moleküler olaylar moleküllerin yoğun popülasyonları içeren ve sükunet içinde veya belirli uyarılması üzerine ya dinamik yeniden düzenlenmesi sergilemek gibi geleneksel ışık mikroskobu tam resmini sağlamaz.
Süper çözünürlüklü görüntüleme kullanımı araştırmacılar çeşitli teknikler kullanarak kırınım sınırı aşmak için izin verdi. PALM ve FIRTINA 6,7 yaklaşık 20 nm'lik bir hassasiyetle moleküllerin yerini yukarı çözmek yeteneğine sahip tek molekül yerelleştirme mikroskobu (SMLM) gibi, ancak, bu teknikler pek çok karelerin üzerine bir görüntü kadar bina, uzun satın alma süreleri güveniyor . Genellikle bu sabit örnekleri gerektirir veya yapıların düşük hareketlilik sergilemek için çok tek flüoroforlar çok noktadan olarak yanlış değildir. Uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) görüntüleme çok seçici konfokal uyarma 8, gerekli tarama yoluyla süper çözünürlük veriyor olsa dayaklaşım görünümünün tam hücre alanları üzerinde yavaş olabilir. STED nedeniyle de tükenme ışınının gücü artışı daha yüksek çözünürlükler için önemli fototoksisite göstermektedir.
Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM 9) standart floresan mikroskop çözünürlüğü iki katına yeteneğine bu yöntemler, bir alternatif sağlar ve geçerli SMLM tekniklerine göre daha canlı hücre görüntüleme ile daha uyumludur. Bu bakış tüm hücre alanları için geniş alan sistemde alt lazer yetkilerini kullanır; satın alma hızları arttı ve standart fluorofor etiketleme ile uyumludur sağlamadan. SIM geniş alan doğa da <100 nm eksenel boyutunda penetrasyon derinlikleri ile, son derece seçici uyarılması için toplam iç yansıma floresan (TIRF) kullanımını izin verir.
Resim korelasyon spektroskopisi (ICS) flüoresan yoğunluğundaki değişiminin ölçülmesi için bir yöntemdir. ICS bir evrim; Uzay-zamansal imYaş korelasyon spektroskopisi (ampüller 10) zaman ve mekan hücre içi floresan sinyalleri ilişkilendirir. Korelasyon fonksiyonu ile geri kalmış çerçeveler içinde pikselleri çevreleyen piksel yoğunlukları ilişkilendirilerek, bilgi akışı hızları ve yön ile ilgili elde edilir. Statik nesneler ampüller analizi ile karışmaz sağlamak için, hareketsiz bir nesne filtre piksel yoğunluğunun bir hareketli ortalama çıkarılarak çalıştığı, uygulanmaktadır.
Burada sunulan teknik, canlı hücreler 11 moleküler akışını ölçmek için süper çözünürlük mikroskopi verileri uygulanan görüntü korelasyon spektroskopisi görüldüğü ilk örnek olduğuna inanılmaktadır. Bu yöntem, ampüller analizi 12 üzerinden F-aktin akışının kırınım sınırlı görüntüleme geliştirir ve ışık kırınım sınırının ötesinde mekansal çözünürlükte elde edilen verilerden, canlı hücrelerde iki boyutlu moleküler akışını belirlemek için isteyen araştırmacıları uygun olur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik görüntüye araştırmacıları izin ve floresan ifade eden hücrelerde daha önce çözümlenemeyen ayrıntıları ölçmek olacaktır. Bizim sonuçlarımıza biz F-aktin T hücresi IS hücre merkezine doğru hücre çevreden simetrik bir şekilde akar göstermektedir. Bu bulgular 1D çizgi profil kymograph verileri 13 önceki sonuçlar ile tutarlıdır ve 2D ve süper çözünürlüklü veri analizi kapasitesini artırmak.
Sunulan teknik, zamanla tek 1D hat üzerinden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
