構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
繊維状アクチンは運動性と、免疫細胞において、免疫学的シナプスとして知られている重要な細胞 – 細胞相互作用の形成を含む細胞プロセスの大部分において重要な役割を果たしています。 F-アクチンは、サブ膜性小胞のダイナミクスとタンパク質のクラスタリングを含む、細胞の膜に分子の分布を調節する役割を果たしていると推測されます。標準の光学顕微鏡技術が一般化し、回折限界の観測を行うことを可能にする一方で、クラスタリングと分子流を含む多くの細胞および分子事象は、これまでの標準的な光学顕微鏡の分解能以下の長さスケールでの集団で発生します。超解像の撮像方法構造化照明顕微鏡で全内部反射蛍光を組み合わせることによって、T細胞の免疫シナプスにおけるF-アクチンの二次元の分子流を記録しました。定量化resulを生成時空間画像相関分光法（STICS）を塗布し、速度ヒストグラムと流れ方向と大きさを表すベクトル・マップの形でTS。このプロトコルは、詳細のサブ回折レベルのフローベクトルを生成する超解像画像とSTICS技術の組み合わせを記載しています。この技術は、シナプス形成の際にT細胞の周囲全体に対称的に逆行し、求心あるアクチンの流れを確認しました。
Introduction
この実験の目的は、画像にあり、免疫学的シナプス（IS）形成中の流れの方向と大きさを確立するために、回折限界を超えて、T細胞を生きにfilamentous-（F-）アクチンの分子流を特徴付けます。この技術は、抗CD3-および抗CD28抗体でコーティングしたカバースリップを活性化する人工シナプスを形成したJurkat T細胞を画像化する、全内部反射蛍光（TIRF）モードでの構造化照明顕微鏡（SIM）を使用して行われます。 T細胞とその標的との間にある形; T細胞受容体（TCR）活性化の際に1,2抗原提示細胞（APC）。これは、適応免疫系は、感染に対する免疫応答を生成するかどうかを決定するための最初のステップであるため、刺激に対する誤った応答の結果は、多くの疾患を引き起こす可能性があります。 T細胞APC相互作用の重要性は十分に立証されているが、成熟の役割（複数可）は、最初のTCR SI後のgnal内在化は、まだ完全には理解されるべきです。
細胞骨格は、TCR活性化（形質膜と細胞骨格アクチン3,4に依存するシグナル伝達分子の制御での分子の動き）に連結された2つのプロセスを支援するために考えられているように、細胞骨格は、空間的及び時間的に再配置する方法を理解する手順を解明しますシナプス形成時の分子の再編成。 F-アクチンの逆流は、この転座は、信号停止やリサイクルのために不可欠であると考えられている、免疫学的シナプスの中心に向かってTCRクラスターを囲いすると考えられています。 T細胞活性化5の微妙なバランスを助けます。
標準的な蛍光顕微鏡法は、細胞 – 細胞相互作用を含む多くの生物学的事象についての洞察を提供し続けて柔軟なツールであるが、それは正確にDIFFRより近くに存在する複数のフルオロフォアを解決するためのシステムの能力によって制限され互いの行動制限（≈200nm）で。細胞内の多くの分子のイベントは、分子の密な集団を伴い、休止中または特定の刺激によりいずれかの動的再配置を示すように、従来の光学顕微鏡は、完全な画像を提供していません。
超解像画像を使用することは、研究者は、様々な技術を用いて、回折限界を回避することができました。 PALM及びSTORM 6,7は約 20ナノメートルの精度で分子の位置を解決する能力を有している単一分子の局在顕微鏡（SMLM）のような、しかし、これらの技術は、多くのフレームの上に画像を構築し、長い取得時間に依存しています。一般に、これは修正されるべきサンプルを必要とするかの構造は、低移動度を示すするため、単一のフルオロフォアは、複数のポイントと誤解されていません。誘導放出の枯渇（STED）イメージングは、非常に選択的共焦点励起8、必要なスキャンにより超解像を可能にするがアプローチは、ビューの全細胞のフィールド全体で遅くなることがあります。 STEDはまた、枯渇ビームのパワーの増加により高い解像度のために重要な光毒性を示します。
構造化照明顕微鏡（SIM 9）は、標準的な蛍光顕微鏡の解像度を倍にすることのできる、これらの方法に代わるものを提供し、現在のSMLM技術よりも生細胞イメージングとの互換性です。これは、ビューの全細胞フィールドの広視野システムの低いレーザパワーを使用しています。取得速度を増加させ、標準的な蛍光団標識と互換性があります提供。 SIMの広視野性質はまた、<100nmの軸方向寸法における侵入深さで、非常に選択的励起のための全反射蛍光（TIRF）の利用が可能になります。
画像相関分光法（ICS）は、蛍光強度の変動を相関させる方法です。 ICSの進化。時空間イム年齢相関分光法（STICS 10）は、時間と空間における細胞内の蛍光シグナルを相関させます。相関関数を経由して、遅れているフレーム内の周辺画素との画素強度を相関させることにより、情報が流れ速度や方向性について得られます。静的オブジェクトはSTICS分析を妨害しないように、不動のオブジェクトフィルタは、ピクセル強度の移動平均を減算することによって動作しており、実装されています。
ここに提示技術は、生細胞における分子流11を定量するために、超解像顕微鏡データに適用される画像相関分光法の最初の実証であると信じられています。この方法は、STICS分析12を介して Fアクチンフローの回折限界画像化を改善し、光の回折限界を超えた空間分解能で取得されたデータから、生細胞中で二次元の分子流を決定したい研究に適するであろう。
Protocol
Representative Results
Discussion
この技術は、画像の研究を可能にし、蛍光を発現する細胞において、以前に解決できない詳細を定量化します。我々の結果では、F-アクチンは、T細胞である、細胞内の中心に向かって細胞周囲から対称的に流れることを示しています。これらの知見は、1次元ラインプロファイルカイモグラフデータ 13からの以前の結果と一致しており、2D超解像データ解析の能力を拡張します。
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response. European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3, 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data. Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).
- Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).
- Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).
