संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी डेटा की spatio- लौकिक छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मात्रा टी कोशिकाओं में cortical एक्टिन प्रवाह
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
Filamentous actin के गतिशीलता और प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, रोग प्रतिरोधक अन्तर्ग्रथन के रूप में जाना एक महत्वपूर्ण सेल सेल बातचीत के गठन सहित सेल प्रक्रियाओं के बहुमत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एफ actin भी उप झिल्लीदार पुटिका गतिशीलता और प्रोटीन क्लस्टरिंग सहित कोशिकाओं की झिल्ली में आणविक वितरण विनियमन में एक भूमिका निभाने के लिए अनुमान लगाया है। मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप तकनीक सामान्यीकृत और विवर्तन सीमित टिप्पणियों किए जाने के लिए अनुमति देते हैं, वहीं क्लस्टरिंग और आणविक प्रवाह सहित कई सेलुलर और आणविक घटनाओं में अब तक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का हल शक्ति से नीचे लंबाई-तराजू पर आबादी में पाए जाते हैं। सुपर संकल्प इमेजिंग विधि संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी के साथ कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति के संयोजन से, टी कोशिकाओं की प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन में एफ actin के दो आयामी आणविक प्रवाह दर्ज किया गया था। Quantifiable रेसुल उत्पन्न करता है जो spatio- लौकिक छवि के सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (Stics) तो लागू किया गया था,वेग histograms और प्रवाह दिशात्मकता और परिमाण का प्रतिनिधित्व वेक्टर नक्शे के रूप में टीएस। इस प्रोटोकॉल के विस्तार के उप-विवर्तन स्तरों पर प्रवाह वैक्टर उत्पन्न करने के लिए सुपर संकल्प इमेजिंग और Stics तकनीक के संयोजन का वर्णन है। इस तकनीक को अन्तर्ग्रथन गठन पर टी कोशिकाओं की परिधि में एक actin संतुलित रूप से पतित है कि प्रवाह और गड़बडिय़ों पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
Introduction
प्रयोग के लक्ष्य की छवि के लिए है और रोग प्रतिरोधक अन्तर्ग्रथन (आईएस) के गठन के दौरान प्रवाह की दिशा और परिमाण स्थापित करने के क्रम में विवर्तन सीमा से परे, टी कोशिकाओं में रहने वाले filamentous- (एफ) actin के आणविक प्रवाह की विशेषताएँ। इस तकनीक विरोधी CD3- और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ लेपित coverslips को सक्रिय करने पर एक कृत्रिम अन्तर्ग्रथन गठन Jurkat टी-कोशिकाओं इमेजिंग, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) मोड में एक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप (सिम) का उपयोग कर बाहर किया जाएगा। एक टी सेल और अपने लक्ष्य के बीच है रूपों; टी सेल रिसेप्टर (TCR) सक्रियण 1,2 पर एक प्रतिजन सेल (एपीसी)। इस अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली एक संक्रमण के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है कि क्या निर्धारित करने में पहला कदम है, के रूप में उत्तेजनाओं को गलत जवाबदेही के परिणामों रोगों के एक नंबर हो सकता है। टी सेल एपीसी बातचीत के महत्व को अच्छी तरह से प्रलेखित है, तथापि, परिपक्व की भूमिका (ओं) प्रारंभिक TCR सी के बाद हैgnal internalization अभी तक पूरी तरह से समझ में आ सकता है।
Cytoskeleton कदम स्पष्ट होगा अस्थायी TCR सक्रियण (प्लाज्मा झिल्ली में अणुओं के आंदोलन और 3,4 cytoskeleton actin पर निर्भर संकेतन अणुओं का नियंत्रण), cytoskeleton स्थानिक rearranges कैसे समझ से जुड़े दो प्रक्रियाओं को सहायता करने के लिए सोचा है के रूप में अन्तर्ग्रथन गठन के दौरान आणविक पुनर्गठन की। एफ actin के पतित प्रवाह प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन के केंद्र की ओर TCR समूहों बाड़ा के लिए सोचा है, इस translocation संकेत समाप्ति और रीसाइक्लिंग के लिए महत्वपूर्ण माना जा रहा है; टी सेल सक्रियण 5 का अच्छा संतुलन सहायता।
मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेल सेल बातचीत सहित कई जैविक घटनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए जारी है कि एक लचीला उपकरण है, यह सही diffr की तुलना में करीब रहने वाले कई fluorophores को हल करने के लिए प्रणाली की क्षमता के द्वारा सीमित हैएक-दूसरे की कार्रवाई सीमा (≈200 एनएम)। कोशिकाओं के भीतर कई आणविक घटनाओं अणुओं के घने आबादी शामिल है और निष्क्रियता में या विशिष्ट उत्तेजना पर या तो गतिशील पुनर्व्यवस्था प्रदर्शनी के रूप में, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी पूरी तस्वीर प्रदान नहीं करता है।
सुपर संकल्प इमेजिंग के उपयोग के शोधकर्ताओं ने विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हुए सीमा विवर्तन नाकाम करने के लिए अनुमति दी गई है। पाम और तूफान 6.7 करीब 20 एनएम के एक सटीक करने के अणुओं के स्थान तक हल करने की क्षमता है एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM) इस तरह के रूप में, हालांकि, इन तकनीकों कई तख्ते पर एक छवि के निर्माण, लंबी अधिग्रहण के समय पर भरोसा । आम तौर पर यह तय होने के लिए नमूने की आवश्यकता है या संरचनाओं कम गतिशीलता का प्रदर्शन करने के लिए बहुत ही fluorophores के कई बिंदुओं के रूप में गलत व्याख्या नहीं कर रहे हैं। प्रेरित उत्सर्जन कमी (STED) इमेजिंग बहुत ही चयनात्मक कोंफोकल उत्तेजना 8, आवश्यक स्कैनिंग के माध्यम से सुपर संकल्प की अनुमति देता है, जबकिदृष्टिकोण को देखने के पूरे सेल क्षेत्रों से अधिक धीमी गति से किया जा सकता है। STED की वजह से भी कमी बीम की शक्ति में वृद्धि करने के लिए उच्च संकल्प के लिए महत्वपूर्ण phototoxicity को दर्शाता है।
संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम 9) एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के संकल्प को दोगुना करने में सक्षम इन तरीकों, के लिए एक विकल्प प्रदान करता है और वर्तमान SMLM तकनीक से जीना सेल इमेजिंग के साथ और अधिक संगत है। यह देखने के पूरे सेल क्षेत्रों के लिए एक व्यापक क्षेत्र सिस्टम पर कम लेजर शक्तियों का उपयोग करता है; अधिग्रहण की गति में वृद्धि हुई है, और मानक fluorophore लेबलिंग के साथ संगत है प्रदान करते हैं। सिम के व्यापक क्षेत्र प्रकृति भी <100 एनएम का अक्षीय आयाम में प्रवेश गहराई के साथ अत्यधिक चयनात्मक उत्तेजना के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) के उपयोग को अनुमति देता है।
छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीएस) प्रतिदीप्ति तीव्रता में उतार चढ़ाव correlating की एक विधि है। आईसीएस का एक विकास; Spatio- लौकिक आईएमउम्र सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (Stics 10) समय और अंतरिक्ष में intracellular फ्लोरोसेंट संकेतों संबद्ध। एक संबंध समारोह के माध्यम से ठंड फ्रेम में पिक्सल के आसपास के साथ पिक्सेल तीव्रता correlating द्वारा, सूचना प्रवाह गति और दिशात्मकता के बारे में प्राप्त की है। स्थिर वस्तुओं Stics विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए, एक स्थिर वस्तु फिल्टर पिक्सेल तीव्रता का एक चलती औसत घटाकर द्वारा काम करता है, जो कार्यान्वित किया जाता है।
यहां प्रस्तुत तकनीक जीवित कोशिकाओं 11 में आणविक प्रवाह यों की सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी डेटा के लिए लागू की जा रही छवि के सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का पहला प्रदर्शन माना जा रहा है। इस विधि Stics विश्लेषण 12 के माध्यम से एफ actin प्रवाह के विवर्तन सीमित इमेजिंग पर सुधार और प्रकाश के विवर्तन सीमा से परे स्थानिक प्रस्तावों पर अधिग्रहीत डेटा से, जीवित कोशिकाओं में दो आयामी आणविक प्रवाह को निर्धारित करने की इच्छा रखने वाले शोधकर्ताओं के अनुरूप होगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस तकनीक की छवि के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति है और प्रतिदीप्ति व्यक्त कोशिकाओं में पहले से unresolvable विवरण यों जाएगा। हमारे परिणामों में हम एफ actin टी सेल है में सेल केंद्र की ओर सेल परिधि से एक सममित फैशन में ब?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
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