Het behandelen van SCA1 Muizen met water-oplosbare verbindingen om niet-specifiek Boost mitochondriale functie
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
Mitochondriale dysfunctie speelt een belangrijke rol bij het verouderingsproces en neurodegeneratieve ziekten waaronder verscheidene erfelijke Spinocerebellaire Ataxie en andere bewegingsstoornissen gekenmerkt door progressieve degeneratie van het cerebellum. Het doel van dit protocol is het mitochondriale dysfunctie spinocerebellaire ataxie type 1 (SCA1) evalueren en de effectiviteit van farmacologische doelwit metabole ademhaling evalueren via de in water oplosbare verbinding barnsteenzuur progressie van de ziekte vertragen. Deze benadering geldt voor andere cerebellum ziekten en kan worden aangepast aan een groot aantal in water oplosbare therapieën.
Ex vivo analyse van mitochondriale respiratie wordt gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van ziekte gerelateerde veranderingen in mitochondriale functie. Genetische bewijs (ongepubliceerde gegevens) en proteomics bewijs van mitochondriale dysfunctie bij SCA1 muismodel, evalueren we het effect van behandeling met de in water oplosbare metabole booster succinic zuur door het oplossen van deze verbinding direct in de kooi drinkwater. Het vermogen van het geneesmiddel om de bloed-hersenbarrière passeert af te leiden met behulp van hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC). De werkzaamheid van deze verbindingen kunnen vervolgens worden getest met meerdere gedragsparadigma's waaronder de versnellende rotarod, balk footprint testen en analyse. Cytoarchitectural integriteit van de kleine hersenen kan worden bepaald met behulp van immunofluorescentie assays dat Purkinjecel kernen en Purkinjecel dendrieten en soma te sporen. Deze methoden zijn robuust technieken voor het bepalen van mitochondriale dysfunctie en de werkzaamheid van de behandeling met in water oplosbare verbindingen in cerebellaire neurodegeneratieve ziekte.
Introduction
Mitochondriën zijn de belangrijkste producenten van adenosine trifosfaat (ATP), een co-enzym essentieel voor cellulaire energie, waarbij het merendeel van mitochondriale ATP geproduceerd door middel van oxidatieve fosforylering (OXPHOS) met de elektronen transportketen. De hersenen, gezien de hoge metabole eisen en de afhankelijkheid van oxidatieve fosforylering voor het voeden van neurale activiteit, is zeer gevoelig voor mitochondriale dysfunctie. Hierdoor wordt mitochondriale dysfunctie geactiveerd tijdens het verouderingsproces 1 en is betrokken bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten 2, 3, 4. Hieruit volgt dat mitochondria aantrekkelijke therapeutische doelwitten voor neurodegeneratie.
In dit protocol, hebben wij het gebruik van spinocerebellaire ataxie type 1 (SCA1) als model neurodegeneratieve ziekte vastgesteld voor de studie van mitochondrial dysfunctie en de ontwikkeling van mitochondriale gerichte therapieën. SCA1 wordt veroorzaakt door polyglutamine (polyQ) repeat expansie mutatie in het ataxine-1 genproduct dat de geleidelijke degeneratie van Purkinje neuronen van het cerebellum en neuronen van andere hersengebieden activeert. De transgene muis lijn hier gebruikt (aangeduid als SCA1 muis), die een polyQ-mutant ataxine-1 transgen onder de controle van een Purkinje-celspecifieke promoter tot expressie brengt, maakt de doelgerichte analyse van de Purkinje-cellen component van SCA1 5. SCA1 muizen ondergaan geleidelijke Purkinjecel degeneratie en ontwikkelen ataxic gang 6.
Mitochondriale dysfunctie complex en mitochondriale gerichte behandeling werkzaamheid kan worden geëvalueerd door een batterij van moleculaire en gedrags-assays. Mitochondriële complex dysfunctie wordt gemeten ex vivo door ademhaling testen die veranderde zuurstofverbruik binnen cerebellum weefsel in te detecterende aanwezigheid van elektronen transportketen substraten en remmers 7. Ademhaling assays zijn eerder gebruikt gepermeabiliseerde weefsel, mitochondrial isolaten en gehele weefsel 7, 8, 9. Zij zorgen voor directe beoordeling van de mitochondriale functie in tegenstelling tot morfologische dataverzameling methoden zoals transmissie-elektronenmicroscopie of immunofluorescentiekleuring. Het gebruik van hele weefsels dan geïsoleerde mitochondria voorkomt vooringenomen selectie van gezonde mitochondriën die kunnen optreden tijdens de isolatiewerkwijze 7. Na aanpassing aan het protocol zoals de ademhaling assay is een waardevolle werkwijze voor het detecteren mitochondriale dysfunctie in cerebellaire neurodegeneratieve ziekten.
Niet-specifieke activatoren van metabolisme kan worden gebruikt om mitochondriale dysfunctie afleiden in transgene muizen modellen van neurodegeneratieve disease en hulp bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Quercetine, co-enzym Q10 en creatine zijn allemaal aangetoond neurodegeneratieve pathologie verbeteren bij patiënten en in diermodellen voor neurodegeneratieve ziekten 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Hier presenteren we een nieuwe metabole activator, barnsteenzuur, het metabolisme stimuleren en mitochondriale neurodegeneratieve ziekte. Opdat de activator is de bloed-hersenbarrière, HPLC werd toegepast voor levering aan neuraal weefsel te detecteren in 17 behandelde muizen.
Om de therapeutische effecten van metabolisch gerichte water oplosbare verbindingen zoals barnsteenzuur evalueren, kan een batterij van gedragsparadigma's en immunopathologische studies worden gebruikt. due de motorische coördinatie in cerebellaire neurodegeneratieve ziekte, de voetafdruk baan assay beam test en versnellen roterende staaf test worden gebruikt om redding van gedrags- pathologie 6, 18, 19 detecteren. Deze maatregelen worden aangevuld met immunopathologische evaluatie van cerebellaire cytoarchitecture door het beoordelen van moleculaire laagdikte (gedefinieerd als Purkinjecel dendritische prieel lengte) en Purkinjecel soma tellingen binnen een bepaalde kwabje van cerebellaire weefsel 6, 20, 21. Hier presenteren we meerdere neuropathologische en gedragsmatige methoden voor de opsporing en behandeling van mitochondriale dysfunctie met metabolisch gerichte water oplosbare verbindingen.
We maken gebruik van ex vivo analyse van mitochondriale ademhaling tot mitochondriale dysfunctie te analyseren in de SCA1 transgenic muis. Verder laten wij ziekte symptomen en pathologie zijn verbeterd door de in water oplosbare mitochondriale booster barnsteenzuur, verder impliceert mitochondriale dysfunctie in SCA1 ziekteprogressie.
Protocol
Representative Results
Discussion
If these methods are used as described, they are capable of detecting and alleviating oxidative phosphorylation-mediated mitochondrial dysfunction in cerebellar neurodegenerative disease mice models. The combined biochemical and behavioral assays are multifaceted methods for determining the extent of mitochondrial contribution to cerebellar neurodegenerative disease pathology. By treating mice with succinic acid to stimulate metabolism and boost mitochondrial function, we are able to show a rescue of cerebellar behaviora…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
