Traiter Souris SCA1 avec hydrosolubles composés à non-Spécifiquement Boost Fonction mitochondriale
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
Le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle important dans le processus de vieillissement et dans les maladies neurodégénératives, y compris plusieurs ataxie spinocérébelleuse héréditaires et d'autres troubles du mouvement marqué par une dégénérescence progressive du cervelet. L'objectif de ce protocole est d'évaluer la dysfonction mitochondriale dans ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et évaluer l'efficacité du ciblage pharmacologique de la respiration métabolique via le composé acide succinique soluble dans l'eau pour ralentir la progression de la maladie. Cette méthode est applicable à d'autres maladies cérébelleux et peut être adaptée à un grand nombre de thérapies solubles dans l'eau.
Une analyse ex vivo de la respiration mitochondriale est utilisée pour détecter et quantifier les changements liés à la maladie de la fonction mitochondriale. Avec des preuves génétiques (données non publiées) et des preuves protéomique de la dysfonction mitochondriale dans le modèle SCA1 de la souris, nous évaluons l'efficacité du traitement avec le rappel métabolique s soluble dans l'eaul'acide uccinic en dissolvant ce composé directement dans l'eau potable à la maison de la cage. La capacité du médicament à traverser la barrière sang-cerveau peut être déduit en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). L'efficacité de ces composés peut ensuite être testé à l'aide de multiples paradigmes comportementaux, y compris le Rotarod accélération, test de poutre d'équilibre et de l'analyse de l'empreinte. l'intégrité cytoarchitecturales du cervelet peut être évaluée en utilisant des tests d'immunofluorescence qui détectent Purkinje noyaux cellulaires et les dendrites des cellules de Purkinje et soma. Ces méthodes sont des techniques fiables pour la détermination de la dysfonction mitochondriale et l'efficacité du traitement avec des composés solubles dans l'eau dans les maladies neurodégénératives cérébelleuse.
Introduction
Les mitochondries sont les principaux producteurs de l'adénosine triphosphate (ATP), un coenzyme essentiel pour l'énergie cellulaire, avec la majorité de l'ATP mitochondrial produit par phosphorylation oxydative (OXPHOS) en utilisant la chaîne de transport d'électrons. Le cerveau, compte tenu de ses besoins métaboliques élevés et de sa dépendance à l'égard de la phosphorylation oxydative pour alimenter l'activité neuronale, est très sensible à un dysfonctionnement mitochondrial. Par conséquent, un dysfonctionnement mitochondrial est déclenchée au cours du processus de vieillissement, 1 et est impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives , 2, 3, 4. Par conséquent, il en résulte que les mitochondries sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour la neurodégénérescence.
Dans ce protocole, nous avons adopté l'utilisation de ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) comme une maladie neurodégénérative modèle pour l'étude des mitochondriesl dysfonctionnement et le développement de thérapies ciblées mitochondriales. SCA1 est causée par une mutation polyglutamine (polyQ) d'extension de répétition dans le produit du gène ataxine-1 qui provoque une dégénérescence progressive des neurones de Purkinje du cervelet et les neurones d'autres régions du cerveau. La lignée de souris transgénique utilisé ici (désignée comme la souris SCA1), qui exprime un polyQ mutant ataxine-1 transgène sous le contrôle d'un promoteur spécifique de Purkinje cellules, permet l'analyse ciblée de l'élément de Purkinje cellules de SCA1 5. Les souris subissent SCA1 progressive dégénérescence des cellules de Purkinje et développent une démarche ataxique 6.
dysfonction mitochondriale et complexe mitochondrial ciblé l'efficacité du traitement peuvent être évalués avec une batterie de tests moléculaires et comportementales. Dysfonction mitochondriale complexe est mesurée ex vivo par des tests de respiration qui détectent la consommation altérée d'oxygène dans les tissus cérébelleusela présence de substrats et inhibiteurs 7 de la chaîne de transport d'électrons. Des dosages de respiration ont déjà été utilisés avec des tissus perméabilisées, les isolats mitochondriaux et les tissus ensemble 7, 8, 9. Ils permettent une évaluation directe de la fonction mitochondriale contrairement aux méthodes de collecte de données morphologiques telles que la microscopie électronique à transmission ou immunofluorescence. L'utilisation de tissu entier plutôt que des mitochondries isolées empêche une sélection biaisée des mitochondries saines qui peuvent survenir au cours du processus d'isolement 7. Lorsque adaptée au protocole comme indiqué, le dosage de la respiration est une méthode utile pour détecter un dysfonctionnement mitochondrial dans les états pathologiques neurodégénératifs cérébelleux.
Des activateurs non spécifiques du métabolisme peuvent être utilisées pour déduire la dysfonction mitochondriale dans les modèles de souris transgéniques de diseas neurodégénérativese et de l'aide à la mise au point de nouvelles thérapies. La quercétine, et de la créatine Coenzyme Q10 ont tous été montré pour améliorer la pathologie de la maladie neuro – dégénérative chez les patients et dans des modèles animaux de maladies neuro – dégénératives 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Nous présentons ici un activateur métabolique roman, l'acide succinique, pour stimuler le métabolisme et stimuler la fonction mitochondriale dans les maladies neurodégénératives. Faire en sorte que l'activateur est de traverser la barrière hémato – encéphalique, la HPLC a été utilisée pour détecter la délivrance d' un tissu neural chez les souris traitées 17.
Pour évaluer les effets thérapeutiques des composés solubles dans l'eau métaboliquement ciblés tels que l'acide succinique, une batterie de paradigmes comportementaux et des études immuno-pathologiques peuvent être utilisés. due aux déficits de la coordination motrice trouvées dans les maladies neuro – dégénératives cérébelleuse, le dosage de la piste de l' empreinte, un dosage de faisceau et l' accélération de dosage de tige de rotation sont utilisés pour détecter le comportement de secours de la pathologie 6, 18, 19. Ces mesures sont complétées par une évaluation de immunopathologique cytoarchitecture cérébelleuse , en évaluant l' épaisseur de la couche moléculaire (définie comme étant la cellule de Purkinje dendritique longueur de l' arbre) et les comptages de Purkinje soma des cellules dans un tissu de lobule défini cérébelleuse 6, 20, 21. Nous présentons ici des méthodes neuropathologiques et comportementales multiples pour la détection et le traitement de la dysfonction mitochondriale avec des composés solubles dans l'eau métaboliquement ciblée.
Nous utilisons une analyse ex vivo de la respiration mitochondriale pour analyser un dysfonctionnement mitochondrial dans la tran SCA1souris sgenic. En outre, nous montrons que les symptômes de la maladie et de la pathologie sont améliorées par l'acide mitochondriale rappel succinique soluble dans l'eau, ce qui implique en outre la dysfonction mitochondriale dans progression de la maladie SCA1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si ces méthodes sont utilisées, comme décrit, ils sont capables de détecter et d'atténuer l'oxydation dysfonctionnement mitochondrial à médiation par la phosphorylation dans des modèles murins de maladies neuro-dégénératives du cervelet. Les tests biochimiques et comportementaux combinés sont des méthodes multiples pour déterminer l'étendue de la contribution mitochondrial à cérébelleux pathologie de la maladie neurodégénérative. En traitant des souris avec de l'acide succinique pour…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
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