El tratamiento de ratones con SCA1 hidrosolubles compuestos para no específicamente estimular la función mitocondrial
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
La disfunción mitocondrial desempeña un papel significativo en el proceso de envejecimiento y en las enfermedades neurodegenerativas incluyendo varios degeneración espinocerebelosa hereditarios y otros trastornos del movimiento marcados por la degeneración progresiva del cerebelo. El objetivo de este protocolo es evaluar la disfunción mitocondrial en la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) y evaluar la eficacia de la orientación farmacológica de la respiración metabólica a través del ácido succínico compuesto soluble en agua para retardar la progresión de la enfermedad. Este enfoque es aplicable a otras enfermedades cerebelares y se puede adaptar a una serie de terapias solubles en agua.
Análisis ex vivo de la respiración mitocondrial se utiliza para detectar y cuantificar los cambios relacionados con la enfermedad en la función mitocondrial. Con la evidencia genética (datos no publicados) y la evidencia de proteómica de la disfunción mitocondrial en el modelo de ratón de SCA1, evaluamos la eficacia del tratamiento con la dosis de refuerzo metabólico s soluble en aguaácido uccinic disolviendo este compuesto directamente en el agua potable jaula. La capacidad del fármaco para pasar la barrera hematoencefálica puede deducirse usando la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La eficacia de estos compuestos puede ensayarse utilizando varios paradigmas de comportamiento entre ellos el rotarod de aceleración, prueba de barra de equilibrio y análisis de la huella. integridad cytoarchitectural del cerebelo se puede evaluar usando ensayos de inmunofluorescencia que detectan núcleos de las células de Purkinje y las dendritas de células de Purkinje y soma. Estos métodos son técnicas robustas para la determinación de la disfunción mitocondrial y la eficacia del tratamiento con los compuestos solubles en agua en la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa.
Introduction
Las mitocondrias son los productores principales de trifosfato de adenosina (ATP), una coenzima esencial para la energía celular, con la mayoría de ATP mitocondrial producido a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) usando la cadena de transporte de electrones. El cerebro, dada su alta demanda metabólica y su dependencia de la fosforilación oxidativa para la alimentación de la actividad neuronal, es altamente susceptible a la disfunción mitocondrial. Como resultado, la disfunción mitocondrial se activa durante el proceso de envejecimiento 1 y está implicada en la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas 2, 3, 4. Por lo tanto, se deduce que las mitocondrias son dianas terapéuticas atractivas para la neurodegeneración.
En este protocolo, hemos adoptado el uso de la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) como una enfermedad neurodegenerativa modelo para el estudio de las mitocondriasl disfunción y el desarrollo de terapias mitocondriales de orientación. SCA1 es causada por una mutación de poliglutamina (polyQ) expansión de repetición en el producto del gen ataxina-1 que desencadena la degeneración progresiva de las neuronas de Purkinje del cerebelo y neuronas de otras regiones del cerebro. La línea de ratón transgénico utilizado aquí (designado como el ratón SCA1), que expresa un polyQ-mutante ataxina-1 transgén bajo el control de un promotor específico de las células Purkinje, permite el análisis específico del componente de las células de Purkinje de SCA1 5. Los ratones con SCA1 sufren degeneración de las células de Purkinje gradual y desarrollan marcha atáxica 6.
La disfunción mitocondrial complejo y la eficacia del tratamiento mitocondrial de orientación pueden ser evaluados con una batería de ensayos moleculares y de comportamiento. La disfunción mitocondrial complejo se mide ex vivo mediante ensayos que detectan la respiración alterada consumo de oxígeno en el tejido del cerebelo enla presencia de sustratos de cadena de transporte de electrones y los inhibidores de 7. Ensayos de respiración se han utilizado previamente con el tejido permeabilized, los aislados mitocondriales, y todo el tejido 7, 8, 9. Permiten una evaluación directa de la función mitocondrial a diferencia de los métodos de recopilación de datos morfológicos como la microscopía electrónica de transmisión o la tinción de inmunofluorescencia. El uso de todo el tejido en lugar de mitocondrias aisladas evita sesgos en la selección de las mitocondrias sanas que pueden ocurrir durante el proceso de aislamiento 7. Cuando se adapta al protocolo como se muestra, el ensayo de respiración es un valioso método para la detección de la disfunción mitocondrial en enfermedades neurodegenerativas del cerebelo.
activadores no específicos del metabolismo pueden utilizarse para inferir la disfunción mitocondrial en modelos de ratones transgénicos de diseas neurodegenerativase y la ayuda en el desarrollo de nuevas terapias. La quercetina, la coenzima Q10 y la creatina han sido mostrado para mejorar la patología enfermedad neurodegenerativa en pacientes y en modelos animales de enfermedad neurodegenerativa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Aquí presentamos un activador metabólico novela, ácido succínico, para estimular el metabolismo y estimular la función mitocondrial en la enfermedad neurodegenerativa. Para asegurarse de que el activador está cruzando la barrera hematoencefálica, HPLC se empleó para detectar la entrega al tejido neural en ratones tratados 17.
Para evaluar los efectos terapéuticos de los compuestos solubles en agua metabólicamente específica tales como el ácido succínico, una batería de paradigmas de comportamiento y estudios inmunopatológicos se puede utilizar. due a los déficits de coordinación motora se encuentran en la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa, el ensayo pista huella, ensayo de haz y la aceleración de ensayo de barra giratoria se usa para detectar rescate de la patología conductual 6, 18, 19. Estas medidas se complementan con la evaluación de inmunopatológico citoarquitectura cerebelosa mediante la evaluación de espesor molecular capa (definida como Purkinje de células dendríticas longitud Arbor) y de Purkinje recuentos soma celular dentro de un lóbulo definido de tejido cerebelar 6, 20, 21. Aquí presentamos varios métodos neuropatológicos y de comportamiento para la detección y el tratamiento de la disfunción mitocondrial con compuestos solubles en agua metabólicamente objetivo.
Utilizamos el análisis ex vivo de la respiración mitocondrial para analizar la disfunción mitocondrial en el tran SCA1sgenic ratón. Además, se muestra que los síntomas de la enfermedad y la patología se mejoran por el ácido succínico refuerzo mitocondrial soluble en agua, implicando más que la disfunción mitocondrial en progresión de la enfermedad SCA1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si se utilizan estos métodos como se describe, que son capaces de detectar y mitigar la disfunción mitocondrial fosforilación mediada oxidativo en modelos de ratones enfermedad neurodegenerativa cerebelosos. Los ensayos bioquímicos y de comportamiento combinados son métodos multifacéticos para determinar el grado de contribución a la patología mitocondrial enfermedad neurodegenerativa cerebelosa. Al tratar a los ratones con ácido succínico para estimular el metabolismo y estimular la función mitocondrial, que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
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