Method Article

טיפול בעכברי SCA1 עם תרכובות מסיסות במים ל- Non-ספציפי להגביר את התפקוד מיטוכונדריאלי

DOI:

10.3791/53758

⸱

January 22nd, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול ביוכימי והתנהגותי להערכת היעילות של תרכובות מסיסות במים ממוקדות מיטוכונדריה לטיפול באטקסיה ספינוצרבלרית מסוג 1 (SCA1) ומחלות ניווניות אחרות של המוח הקטן.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקוד המיטוכונדריה ממלא תפקיד משמעותי בתהליך ההזדקנות במחלות ניווניות כוללים כמה ataxias spinocerebellar התורשתי והפרעות תנועה אחרות בסימן ניוון הדרגתי של המוח הקטן. מטרת פרוטוקול זה היא להעריך תפקוד המיטוכונדריה ב אטקסיה spinocerebellar סוג 1 (SCA1) ולהעריך את היעילות של מיקוד תרופתי נשימה מטבוליים באמצעות חומצת succinic תרכובת מסיסה במים כדי להאט את התקדמות מחלה. גישה זו ישימה מחלות אחרות של מוח קטנות והוא יכול להיות מותאם כדי שורה של טיפולים מסיסים במים.

Ex vivo ניתוח הנשימה המיטוכונדריאלי משמש כדי לזהות ולכמת את השינויים הקשורים למחלות במיטוכונדריה. עם ראיות גנטיות (נתונים שלא פורסמו) וראיות proteomic של תפקוד המיטוכונדריה במודל עכבר SCA1, אנו להעריך את היעילות של טיפול עם הים מאיץ מטבולית מסיס במיםחומצה uccinic ידי המסת תרכובת זו ישירות אל תוך מי השתייה בכלוב בבית. היכולת של התרופה כדי לעבור את מחסום דם המוח אפשר להסיק דרך כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). יעילותה של תרכובות אלה לאחר מכן ניתן לבדוק באמצעות פרדיגמות התנהגותיים מרובות כולל rotarod המאיץ, מבחן בקורה וניתוח טביעת רגל. שלמות Cytoarchitectural של המוח הקטן ניתן להעריך באמצעות מבחני immunofluorescence המאתרות גרעיני תאים פורקינג דנדריטים תא פורקינג סומה. שיטות אלה הן טכניקות חזקות לקביעת תפקוד המיטוכונדריה ואת יעילות הטיפול עם תרכובות מסיסות במים במחלת ניוון עצבית במוח קטן.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיטוכונדריה הם המפיקים המפתח של אדנוזין אדנוזין (ATP), גידול אנזים חיוני האנרגיה התאית, עם רוב ATP במיטוכונדריה המיוצר באמצעות זירחון חמצוני (OXPHOS) באמצעות שרשרת העברת אלקטרונים. המוח, נתון דרישות מטבוליות הגבוהה שלה הסתמכותו על זירחון חמצונים להפעלת פעילות עצבית, הוא רגיש מאוד תפקוד המיטוכונדריה. כתוצאה מכך, תפקוד המיטוכונדריה הופעל במהלך תהליך ההזדקנות 1 והוא מעורב בפתוגנזה של מחלות ניווניות מספר 2, 3, 4. לכן, המסקנה היא כי המיטוכונדריה הם מטרות טיפוליות אטרקטיבית ניווניות של מערכת העצבים.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות IACUC ב סקידמור קולג לעבודה עם עכברים.

1. טיפול עם תרכובות מסיסות במים

  1. ממיסים חומצה succinic לריכוז של 0.75 מ"ג / מ"ל ​​במי השתייה כלוב. שים לב כל תרכובת מסיס במים עניין בריכוז הרצוי יוכל להחליף אותו בשלב זה. מערבבים פתרון לוודא כי המתחם נמס לגמרי.
  2. לאחר עכברים מגיעים לגיל הטיפול הרצוי, להחליף את המים לשתייה בכלוב בבית של הקבוצה במצב הטיפול עם הפתרון בשלב 1.1.
  3. מדד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מיקוד תרופתי של המיטוכונדריה במוח הקטן עם חומצה succinic אנו מסוגלים למנוע תפקוד המיטוכונדריה במודל של עכברים של SCA1 מחלות ניווניות של המוח הקטן. תורם האלקטרונים הקנונית של דהידרוגנז succinate, חומצת succinic, פורק ב מי שתייה בכלוב בבית של עכברי SCA1 במשך חודש, עם תחילת ערכה התנהגותית במהלך השבוע השני של טיפול וערכת נוירו לאחר הטיפול (איור 1 א). הטיפול בחומצה Succinic 22 משפר את הבי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אם שיטות אלה משמשים כמתואר, הם מסוגל לאתר והקלה על תפקוד המיטוכונדריה בתיווך זרחון חמצוני במודלים עכברים מחלות ניווניות של המוח הקטן. מבחני ביוכימיים והתנהגותיים בשילוב שיטות רבות לקביעת מידת תרומת המיטוכונדריה לפתולוגיה מחלות ניווניות של המוח הקטנה. על ידי טיפול בעכברים עם חומצת succinic להגברת חילוף חומרים ואת להגביר את התפקוד המיטוכונדריה, אנו מסוגלים להציג הצלה של גירעונות התנהגותי מוח קטנים וניוון המוח קטן.

.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לד"ר הארי אור מאוניברסיטת מינסוטה על תרומתו הנדיבה של עכברים מהונדסים. ברצוננו להודות גם לבוגרי מכללת סקידמור הבאים על עבודתם בביצוע הניסויים הקודמים: מוניקה וילגאס, פורטר הול, מיטשל ספרינג, ניקולס טוקר, ג'ני ז'אנג, קלואי לארסון ושיאן סלוקום. יתר על כן, ברצוננו להודות למכללת סקידמור על מימון פיתוח השיטות הללו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אדנוזין דיפוספטסיגמא אולדריץ'A2754ADP
אסקורבטסיגמא אולדריץ'A7631
אלבומין סרום בקרסיגמא אולדריץ'A2153BSA
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדולסיגמא אולדריץ'D9542DAPI
דיגיטוניןסיגמא אולדריץ'D141
דיתיותרייטולסיגמא אולדריץ'D0632
DTT סרום חמורסיגמא אולדריץ'D9663
גלוטמטסיגמא אולדריץ'1446600
מלאטסיגמא אולדריץ'6994
מניטולסיגמא אולדריץ'M4125
פרפורמלדהידסיגמא אולדריץ'P6148
אשלגן-לקטוביונאטביו-סוכרים69313-67-3
רוטנוןסיגמא אולדריץ'R8875
ספוניןסיגמא אולדריץ'47036
חומצה סוקסיניתסיגמא אולדריץ'S3674
N,N,N&פריים;,N&פריים; -Tetramethyl-p-phenylenediamineSigma AldrichT7394TMPD
Triton X-100Sigma AldrichT9284
UreaSigma AldrichU0631
Vectashield הרכבה בינוניתVector LabsH-1000
<נוגדנים חזקים>
11NQ (אנטי אטקסין-1 )Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 נוגדן משני נגד עכברLife TechnologiesA-11015
Alexa Fluor 594 נוגדן משני נגד ארנבLife TechnologiesA-11012
נוגדן קלבינדין (עז)Santa CruzC-20
<חזק>בעלי חיים
לשלוט בעכברים טרנסגנייםהארי אור, Ph.D.A02Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
עכברי SCA1הארי אור, Ph.D.B05Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
עכברים מסוג פראמעבדת ג'קסון001800
Equipment
ESM-100L מיקרוטוםERMASledge microtome
Fluoview FV1200 מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוס
גליצרול-ג'לטין שקופיותFD Neuro TechnologiesPO101
מזרק המילטוןסיגמא אולדריץ'VCAT 80465
OXYT1 יחידת בקרת אלקטרודות OxythermHansatech Instruments
P.T.F.E.Cole-ParmerUX-08277-15
Rotallion RotarodPPP& Gצור קשר עם המחבר המקביל לקבלת מידע
Ultimate 3000 HPLCDionex
Software
ImageJNational Institute of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
תוסף מונה תאים (עבור ImageJ)המכון הלאומי לבריאותhttp://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P& G Rota-Rod v3.3.3 (תוכנת rotarod)PPP& Gצור קשר עם המחבר המתאים לקבלת מידע
Phidget21.dll (נדרש לתוכנת rotarod)DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html
נייר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SCA1 MiceMitochondrial FunctionWater Soluble CompoundsSuccinic Acid TreatmentBehavioral AssaysImmunofluorescence AssaysHPLC AnalysisMitochondrial RespirationCerebellar TissueNeurodegenerative Disease

Related Articles