טיפול בעכברי SCA1 עם תרכובות מסיסות במים ל- Non-ספציפי להגביר את התפקוד מיטוכונדריאלי
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
תפקוד המיטוכונדריה ממלא תפקיד משמעותי בתהליך ההזדקנות במחלות ניווניות כוללים כמה ataxias spinocerebellar התורשתי והפרעות תנועה אחרות בסימן ניוון הדרגתי של המוח הקטן. מטרת פרוטוקול זה היא להעריך תפקוד המיטוכונדריה ב אטקסיה spinocerebellar סוג 1 (SCA1) ולהעריך את היעילות של מיקוד תרופתי נשימה מטבוליים באמצעות חומצת succinic תרכובת מסיסה במים כדי להאט את התקדמות מחלה. גישה זו ישימה מחלות אחרות של מוח קטנות והוא יכול להיות מותאם כדי שורה של טיפולים מסיסים במים.
Ex vivo ניתוח הנשימה המיטוכונדריאלי משמש כדי לזהות ולכמת את השינויים הקשורים למחלות במיטוכונדריה. עם ראיות גנטיות (נתונים שלא פורסמו) וראיות proteomic של תפקוד המיטוכונדריה במודל עכבר SCA1, אנו להעריך את היעילות של טיפול עם הים מאיץ מטבולית מסיס במיםחומצה uccinic ידי המסת תרכובת זו ישירות אל תוך מי השתייה בכלוב בבית. היכולת של התרופה כדי לעבור את מחסום דם המוח אפשר להסיק דרך כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). יעילותה של תרכובות אלה לאחר מכן ניתן לבדוק באמצעות פרדיגמות התנהגותיים מרובות כולל rotarod המאיץ, מבחן בקורה וניתוח טביעת רגל. שלמות Cytoarchitectural של המוח הקטן ניתן להעריך באמצעות מבחני immunofluorescence המאתרות גרעיני תאים פורקינג דנדריטים תא פורקינג סומה. שיטות אלה הן טכניקות חזקות לקביעת תפקוד המיטוכונדריה ואת יעילות הטיפול עם תרכובות מסיסות במים במחלת ניוון עצבית במוח קטן.
Introduction
המיטוכונדריה הם המפיקים המפתח של אדנוזין אדנוזין (ATP), גידול אנזים חיוני האנרגיה התאית, עם רוב ATP במיטוכונדריה המיוצר באמצעות זירחון חמצוני (OXPHOS) באמצעות שרשרת העברת אלקטרונים. המוח, נתון דרישות מטבוליות הגבוהה שלה הסתמכותו על זירחון חמצונים להפעלת פעילות עצבית, הוא רגיש מאוד תפקוד המיטוכונדריה. כתוצאה מכך, תפקוד המיטוכונדריה הופעל במהלך תהליך ההזדקנות 1 והוא מעורב בפתוגנזה של מחלות ניווניות מספר 2, 3, 4. לכן, המסקנה היא כי המיטוכונדריה הם מטרות טיפוליות אטרקטיבית ניווניות של מערכת העצבים.
בפרוטוקול זה, אימצנו את השימוש בסוג אטקסיה spinocerebellar 1 (SCA1) כמחלה ניווניות מודל לחקר המיטוכונדריהl תפקוד והתפתחות טיפולים במיקוד המיטוכונדריה. SCA1 נגרמת על ידי מוטציה הרחבת חוזרים polyglutamine (polyQ) במוצר הגן ataxin-1 אשר מפעילה ניוון הדרגתי של נוירונים פורקינג של המוח הקטן ונוירונים של אזורי מוח אחרים. שורת העכבר המהונדסת משמשת כאן (יועד עכבר SCA1), אשר מבטאת transgene polyQ מוטנטי ataxin-1 תחת השליטה של מקדם ספציפי תאי פורקינג, מאפשרת ניתוח הממוקד של רכיב פורקינג התאים של SCA1 5. עכברים SCA1 לעבור ניוון פורקינג תא הדרגתי ולפתח הילוך 6 Ataxic.
תפקוד מורכב מיטוכונדריאלי ואת יעילות טיפול במיקוד המיטוכונדריה ניתן להעריך עם סוללה של מבחנים מולקולריים והתנהגותיים. תפקוד מורכב מיטוכונדריאלי נמדד לשעבר vivo על ידי מבחני נשימה מאתרים צריכת חמצן שינתה בתוך רקמת המוח הקטנה בבנוכחות מצעים ומעכבי שרשרת העברת אלקטרונים 7. מבחני נשימה בעבר שימשו עם רקמת permeabilized, מבודד המיטוכונדריה, ושלמים רקמות 7, 8, 9. הם מאפשרים הערכה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בניגוד לשיטות איסוף נתונים מורפולוגיים כגון מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים או מכתים immunofluorescence. השימוש כולו רקמות ולא המיטוכונדריה מבודד ומונע מבחר מוטה של המיטוכונדריה בריאה שעלולות להתרחש במהלך תהליך הבידוד 7. כאשר המותאמים פרוטוקול כמוצג, assay הנשימה היא שיטה ערך לאיתור תפקוד המיטוכונדריה במדינות מחלות ניווניות של המוח הקטן.
activators שאינו ספציפי של חילוף חומרים שניתן להשתמש בם כדי להסיק תפקוד המיטוכונדריה במודלי עכברים מהונדסים של diseas ניווניותדואר וסיוע בפיתוח טיפולים חדשים. קוורצטין, קואנזים Q10 ו קריאטין כל הוכח כדי לשפר פתולוגיה מחלות ניווניות בחולים והן במודלים של בעלי חיים של מחלות ניווניות 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. כאן אנו מציגים מפעיל מטבולית הרומן, חומצה succinic, להגברת חילוף החומרים ואת להגביר את תפקוד המיטוכונדריה מחלות ניווניות. כדי להבטיח כי מפעיל חוצה את מחסום דם המוח, הועסקה HPLC לזהות למסירת רקמה עצבית בעכברים שטופלו 17.
כדי להעריך את ההשפעות הטיפוליות של תרכובות מסיסות במים ממוקדים מבחינת מטבולית כגון חומצת succinic, סוללה של פרדיגמות התנהגותיים ומחקרי immunopathological ניתן להשתמש. duדואר אל גירעונות הקואורדינציה המוטורית שמוצאים במחלת ניוון עצבה מוח קטן, assay מסלול הסימן עקב, assay assay קורה המוט מסתובב מאיץ המשמש לאיתור הצלה של פתולוגיה התנהגותית 6, 18, 19. אמצעים אלה הם השלימו עם הערכת immunopathological של cytoarchitecture המוח הקטן על ידי הערכת עובי שכבה מולקולרית (מוגדר אורך סוכת הדנדריטים תא פורקינג) וספירת סומה תא פורקינג בתוך אונה מוגדרת של מוח קטן רקמות 6, 20, 21. כאן אנו מציגים שיטות נוירו והתנהגותיים מרובות לאיתור וטיפול תפקוד המיטוכונדריה עם תרכובות מסיסות במים ממוקדים מבחינה מטבולית.
אנו משתמשים בניתוח vivo לשעבר של הנשימה המיטוכונדריאלי לנתח תפקוד המיטוכונדריה של טראן SCA1עכבר sgenic. יתר על כן, אנו מראים כי תסמיני המחלה והפתולוגיה משתפרים על ידי חומצה succinic המאיץ המיטוכונדריה מסיסים במים, עוד להפליל תפקוד המיטוכונדריה בהתקדמות המחלה SCA1.
Protocol
Representative Results
Discussion
אם שיטות אלה משמשים כמתואר, הם מסוגל לאתר והקלה על תפקוד המיטוכונדריה בתיווך זרחון חמצוני במודלים עכברים מחלות ניווניות של המוח הקטן. מבחני ביוכימיים והתנהגותיים בשילוב שיטות רבות לקביעת מידת תרומת המיטוכונדריה לפתולוגיה מחלות ניווניות של המוח הקטנה. על ידי טיפול ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
