Tratar ratos SCA1 com solúvel em água compostos não especificamente impulsionar a função mitocondrial
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
disfunção mitocondrial desempenha um papel significativo no processo de envelhecimento e em várias doenças neurodegenerativas, incluindo as ataxias espinocerebelares hereditárias e outras perturbações do movimento marcadas pela degeneração progressiva do cerebelo. O objetivo deste protocolo é avaliar disfunção mitocondrial em ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) e avaliar a eficácia da segmentação farmacológico da respiração metabólica através do ácido succínico composto solúvel em água para retardar a progressão da doença. Esta abordagem é aplicável a outras doenças cerebelares e pode ser adaptado a uma série de terapias solúveis em água.
Análise ex vivo da respiração mitocondrial é utilizado para detectar e quantificar as alterações relacionadas com a doença em função mitocondrial. Com a evidência genética (dados não publicados) e as provas proteômica de disfunção mitocondrial no modelo do rato SCA1, podemos avaliar a eficácia do tratamento com o metabólica impulsionador s solúvel em águaácido uccinic por dissolução deste composto directamente na água de beber casa gaiola. A capacidade do fármaco para passar a barreira hemato-encefálica pode ser deduzida utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A eficácia destes compostos pode ser testada usando múltiplos paradigmas comportamentais, incluindo o rotarod aceleração, teste trave de equilíbrio e análise da pegada. integridade citoarquitectónica do cerebelo pode ser avaliada através de imunofluorescência que detectam os núcleos das células de Purkinje e dendritos das células de Purkinje e soma. Estes métodos são técnicas robustas para a determinação da disfunção mitocondrial e a eficácia do tratamento com compostos solúveis em água na doença neurodegenerativa cerebelar.
Introduction
As mitocôndrias são os principais produtores de trifosfato de adenosina (ATP), uma co-enzima essencial para a energia celular, com a maioria do ATP mitocondrial produzido através da fosforilação oxidativa (FOX) usando a cadeia de transporte de electrões. O cérebro, dadas as suas elevadas exigências metabólicas e sua dependência de fosforilação oxidativa para alimentar a atividade neural, é altamente suscetível a disfunção mitocondrial. Como resultado, disfunção mitocondrial é accionado durante o processo de envelhecimento 1 e está implicada na patogénese de várias doenças neurodegenerativas, 2, 3, 4. Portanto, segue-se que as mitocôndrias são alvos terapêuticos atractivos para a neurodegeneração.
Neste protocolo, adotamos o uso de ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) como uma doença neurodegenerativa modelo para o estudo das mitocôndriasl disfunção e ao desenvolvimento de terapias alvo-mitocondriais. SCA1 é causada por uma mutação de poliglutamina (poliQ) expansão repetida no produto do gene ataxin-1 que desencadeia a progressiva degeneração dos neurónios de Purkinje do cerebelo e neurónios de outras regiões do cérebro. A linha transgénica rato usado aqui (designado como o rato SCA1), que expressa uma ataxin-1 transgene poliQ-mutante sob o controlo de um promotor específico de células de Purkinje, permite a análise orientada de o componente das células de Purkinje de SCA1 5. Ratos SCA1 sofrer degeneração das células de Purkinje gradual e desenvolver marcha atáxica 6.
disfunção complexo mitocondrial e eficácia do tratamento alvejado-mitocondrial pode ser avaliada com uma bateria de ensaios moleculares e comportamentais. Disfunção complexo mitocondrial é medida ex vivo através de ensaios de respiração que detectam o consumo de oxigénio no tecido cerebelar alterada ema presença de substratos cadeia de transporte de elétrons e inibidores 7. Os ensaios de respiração foram previamente utilizadas com tecido permeabilizada, isolados mitocondriais, e tecido inteiro 7, 8, 9. Eles permitem a avaliação direta da função mitocondrial ao contrário dos métodos de recolha de dados morfológicos, como a microscopia eletrônica de transmissão ou imunofluorescência. O uso de tecido todo em vez de isolado mitocôndrias impede a seleção tendenciosa de mitocôndrias saudáveis que podem ocorrer durante o processo de isolamento 7. Quando adaptadas ao protocolo como mostrado, o ensaio a respiração é um valioso método para a detecção de disfunção mitocondrial em estados de doenças neurodegenerativas do cerebelo.
activadores não específica de metabolismo pode ser usada para inferir a disfunção mitocondrial em modelos de ratinhos transgénicos de diseas neurodegenerativasE e auxílio no desenvolvimento de novas terapias. A quercetina, coenzima Q10 e creatina têm sido mostrados para melhorar a patologia neurodegenerativa doença em doentes e em modelos animais de doença neurodegenerativa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Aqui nós apresentamos um novo activador metabólico, ácido succínico, para estimular o metabolismo e aumentar a função mitocondrial na doença neurodegenerativa. Para assegurar que o activador é de atravessar a barreira hemato-encefálica, a HPLC foi utilizada para detectar a entrega ao tecido neural em ratinhos tratados 17.
Para avaliar os efeitos terapêuticos dos compostos solúveis em água metabolicamente alvo, tais como ácido succínico, uma bateria de paradigmas comportamentais e estudos imunopatológicos pode ser usado. due para os défices de coordenação motora encontradas na doença neurodegenerativa cerebelar, o ensaio de pista pegada, ensaio de feixe e ensaio da haste rotativa aceleração são usados para detectar salvamento de patologia comportamental 6, 18, 19. Estas medidas são completadas com a avaliação imunopatológico da citoarquitetura cerebelar, avaliando a espessura molecular camada (definido como o comprimento do mandril Purkinje dendrítica celular) e contagens de células de Purkinje soma dentro de um lóbulo definida de tecido cerebelar 6, 20, 21. Aqui apresentamos vários métodos neuropatológicas e comportamentais para a detecção e tratamento da disfunção mitocondrial com compostos solúveis em água metabolicamente alvo.
Nós usamos a análise ex vivo da respiração mitocondrial para analisar a disfunção mitocondrial na tran SCA1rato sgenic. Além disso, mostra-se que os sintomas da doença e patologia são melhoradas pelo impulsionador ácido succínico mitocondrial solúvel em água, implicando ainda a disfunção mitocondrial na progressão da doença SCA1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se estes métodos são usados, conforme descrito, eles são capazes de detectar e aliviar a disfunção mitocondrial mediada por fosforilação oxidativa em modelos de ratos doenças neurodegenerativas cerebelares. Os ensaios bioquímicos e comportamentais combinados são métodos multifacetadas para determinar a extensão da contribuição mitocondrial para cerebelar patologia doença neurodegenerativa. Ao tratar ratos com ácido succínico para estimular o metabolismo e aumentar a função mitocondrial, somos capazes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
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