نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) يصف عملية ظهارة transdifferentiating في اللحمة المتوسطة. EMT هو عملية أساسية أثناء التطور الجنيني الذي يحدث أيضا عادة في الإصابة بالورم الأرومي الدبقي، والأكثر شيوعا ورم خبيث في الدماغ. كما لوحظ EMT في سرطان متعددة خارج الدماغ بما في ذلك سرطان الثدي، سرطان الرئة، سرطان القولون، وسرطان المعدة. يرتبط EMT مركزيا إلى خبيثة من خلال تشجيع الهجرة والغزو وتشكيل ورم خبيث. ليست مفهومة تماما آليات EMT الاستقراء. نحن هنا وصف نظام في المختبر لعزل موحدة الخلايا القشرية الجذعية العصبية (NSCs) ولاحق EMT الاستقراء. ويوفر هذا النظام المرونة اللازمة لاستخدام إما الخلايا واحد أو ثقافة يزدرع. في هذا النظام، الفئران أو الماوس NSCs الدماغ المقدم الجنينية يتم تربيتها في وسط محددة، خالية من المصل والانزيمات. أعربت NSCs Olig2 وSox10، وهما عوامل النسخ التي لوحظت في oligodendrocخلايا YTE السلائف (يجد OPCs). باستخدام هذا النظام، والتفاعلات بين FGF-، BMP- وTGFβ-إشارات تنطوي Zeb1، Zeb2، ولوحظت Twist2 حيث TGFβ تفعيل زيادة كبيرة الهجرة الخلية، مما يشير إلى التآزر BMP- / TGFβ التفاعل. وتشير النتائج إلى شبكة من FGF-، BMP- وTGFβ-يشير إلى أن تشارك في EMT تحريض والصيانة. هذا النظام النموذج هو ذات الصلة لتحقيق EMT في المختبر. فمن فعالة من حيث التكلفة ويظهر استنساخ عالية. كما أنه يسمح للمقارنة بين المركبات المختلفة فيما يتعلق الردود هجرتهم (قياس المسافة الكمي)، وفحص الإنتاجية العالية من المركبات على تثبيط أو تعزيز EMT (قياس النوعية). ولذا فإن نموذج مناسبة تماما لاختبار مكتبات المخدرات عن المواد التي تؤثر EMT.
Introduction
خلال عدة مراحل من التطور الجنيني، تفقد الخلايا الظهارية الالتزام القوي لبعضها البعض (على سبيل المثال، منعطفات ضيقة) والحصول على النمط الظاهري المهاجرة في عملية تسمى الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) 1. مطلوب EMT لتشكيل أنواع الخلايا إضافية، مثل الخلايا العصبية قمة الوسيطة، يبلغ عدد سكانها أن تفصل من الظهارة العصبية 2. EMT ليست ضرورية فقط خلال المراحل الجنينية ولكن المطلوب أيضا في مراحل لاحقة من حياة الكبار للحفاظ على العمليات الفسيولوجية في الكائن الحي الكبار، مثل التئام الجروح 3 والجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد في المزيل للآفات 4.
ومن المعروف الأورام الظهارية لإعادة تنشيط EMT كخطوة بدء الهجرة والغزو وورم خبيث، مما يؤدي في النهاية الى الاصابة بالسرطان تقدم 1،3. في الواقع يرتبط EMT مركزيا إلى 1،3 الهجرة قوي. الخطوات الخلوية جonditioning، بدء، يمر بها والحفاظ على EMT لا تكون مفهومة تماما وتحتاج إلى مزيد من التحقيق.
هنا، يتم تقديم في المختبر نظام نموذجي موحد EMT على أساس NSCs، مع عوامل النمو تعريف وسائل الإعلام (أي مصل ولا استخدام انزيم). هذا النظام النموذج هو من أهمية للعلماء تعمل على EMT. وقد ثبت الحلزون، زيب وتويست أسر البروتين أن تكون حاسمة لEMT سواء في التنمية ومرض 1. وتشارك الحلزون، زيب وتويست العائلات أيضا في نظام المقدمة. ويستند هذا النظام على منطقة محددة من الدماغ الأمامي التي عادة لا يخضع EMT توفير ميزة خاصة لدراسة الأحداث الأولية خلال EMT الاستقراء.
من المحتمل أن يتم تطبيق نظام نموذجي لدراسة EMT في ظهائر خارج الجهاز العصبي المركزي، منذ محرضات EMT الأساسية، مثل الحلزون، زيب والبروتينات تويست، تم العثور أيضا خلال EMT في أنظمة الأنسجة خارج الجهاز العصبي المركزي. هذا النموذج الصورةystem يسمح للعزلة موحدة من NSCs من القشرة النامية لدراسة خصائص الخلايا الجذعية بشكل عام وEMT على وجه الخصوص. باستخدام هذا النظام، ونحن عزل NSCs، EMT يسببها ودرس الهجرة لاحقة تحت تأثير FGF2 وBMP4. لاحظنا أن FGF- وBMP-يشير يتفاعل مع TGFβ مما يشير إلى تشجيع الهجرة الخلية، وبالتالي إضفاء الشرعية على نظام نموذجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة تم وصف نظام موحد لEMT تحليل NSCs استخدام (تلخيصها في الشكل التكميلي 3). توحيد يضمن استنساخ (الجدول 1 و 2). وتستمد NSCs من القشرة النامية، والأنسجة التي عادة لا يخضع EMT. هذا هو ميزة لتحليل الخطوات الأولى في EMT. الخطوات الأولية في EMT لا يمكن دراستها…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل مؤسسة جامعة بازل علوم ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية عن طريق منحة إلى MHS وAG (الجبهة الوطنية الصومالية IZLIZ3_157230). نشكر الدكتور تانيا رينالدي Burkat لتوفير بسخاء البنية التحتية. جميع أعضاء مجموعة Bettler للمناقشات وتعليقات. نشكر جيرهارد Dorne (لايكا مايكروسيستمز، سويسرا) لتركيب المهنية والكفاءة للالكاملة كاميرا الفيديو HD MC170 (لايكا مايكروسيستمز، سويسرا).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
References
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
- Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
- Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
- Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. . Atlas of the developing rat nervous system. , (1994).
- O’Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
- O’Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
- Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
- Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
- Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
- Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
- Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
- Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
- Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
- Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
- Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
- Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
- Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
- Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
- Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
- Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
- Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
- McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
- Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
- Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
- Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
- Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
- Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment – migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).
