Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Épithéliale de transition mésenchymateuses (EMT) décrit le processus de l'épithélium transdifferentiating en mésenchyme. EMT est un processus fondamental au cours du développement embryonnaire qui se produit également souvent dans le glioblastome, la tumeur la plus fréquente du cerveau maligne. EMT a également été observé dans de nombreux cancers, y compris en dehors du cerveau cancer du sein, le cancer du poumon, le cancer du côlon, le cancer gastrique. EMT est lié au centre de malignité en favorisant la migration, l'invasion et la formation de métastases. Les mécanismes de EMT induction ne sont pas pleinement compris. Nous décrivons ici un système in vitro pour isoler des cellules corticales normalisé souches neurales (NSC) et l' induction subséquente EMT. Ce système offre la possibilité d'utiliser soit des cellules simples ou explant. Dans ce système, un rat ou la souris NNC prosencéphale embryonnaires sont mises en culture dans un milieu défini, dépourvu de sérum et les enzymes. Les NSCs exprimés Olig2 et Sox10, deux facteurs de transcription observée dans oligodendrocles cellules précurseurs yte (OPC). En utilisant ce système, les interactions entre les FGF, TGF et BMP signalisation impliquant ZEB1, ZEB2 et Twist2 ont été observées lorsque la TGFß activation améliorée de manière significative la migration des cellules, ce qui suggère une BMP / TGF-interaction synergique. Les résultats indiquent un réseau de FGF, BMP et TGF-signalisation d'être impliqués dans EMT induction et l'entretien. Ce système de modèle est utile pour étudier EMT in vitro. Il est rentable et présente une forte reproductibilité. Il permet également la comparaison des différents composés par rapport à leurs réponses de migration (de mesure de distance quantitative), et le criblage à haut débit de composés à inhiber ou amplifier EMT (mesure qualitative). Le modèle est donc bien adapté pour tester les bibliothèques de médicaments pour les substances affectant EMT.
Introduction
Pendant plusieurs stades du développement embryonnaire, les cellules épithéliales perdent leur forte adhérence à l'autre (par exemple, les jonctions serrées) et d' acquérir un phénotype migratoire dans un processus appelé transition épithélio mésenchymateuse (EMT) 1. EMT est requis pour la formation d' autres types de cellules, telles que les cellules de la crête neurale mésenchymateuses, une population qui se sépare de la neuroepithelium 2. EMT est essentielle non seulement au cours des stades embryonnaires , mais aussi nécessaire à des étapes ultérieures de la vie adulte pour maintenir les processus physiologiques dans l'organisme adulte, comme la cicatrisation 3 et le système nerveux central (SNC) dans la régénération des lésions démyélinisantes 4.
Les tumeurs épithéliales sont connus pour réactiver EMT comme une étape d'initiation pour la migration, l' invasion et les métastases, conduisant finalement à la progression du cancer 1,3. EMT est en effet lié au centre de la forte 1,3 de migration. Les étapes cellulaires de conditioning, initier, subissant et maintenir EMT ne sont pas pleinement compris et ont besoin d'une enquête plus approfondie.
Ici, un système in vitro de modèle normalisé basé sur EMT NNC, des facteurs de croissance définis et des milieux (sans sérum et sans l' utilisation de l' enzyme) est présentée. Ce système modèle est pertinent pour les scientifiques travaillant sur EMT. Les escargots, Zeb et Twist familles de protéines se sont avérés être critique pour EMT tant dans le développement et la maladie 1. Les escargots, Zeb et Twist familles sont également impliqués dans le système présenté. Le système est basé sur une région spécifique du cerveau antérieur qui, normalement, ne subit pas de EMT fournir un avantage particulier pour l'étude des premiers événements au cours EMT induction.
Le système de modèle pourrait être appliquée à l'étude EMT dans les épithéliums en dehors du système nerveux central, depuis inducteurs EMT clés, tels que l'escargot, Zeb et les protéines Twist, sont également présents au cours EMT dans les systèmes de tissus en dehors du système nerveux central. Ce modèle système permet l'isolement normalisé de NNC du cortex en développement pour étudier les caractéristiques de cellules souches en général et EMT en particulier. Grâce à ce système, nous avons isolé NSCs, EMT induite et étudié la migration ultérieure sous l'effet de FGF2 et BMP4. Nous avons observé que interagit FGF et BMP-signalisation avec TGF-signalisation pour promouvoir la migration cellulaire, validant ainsi le système modèle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude , un système standardisé pour EMT analyse NSCs utilisant est décrite (résumé dans la figure complémentaire 3). La normalisation permet la reproductibilité (Tableau 1 et 2). Les NNC sont dérivées du cortex développement, un tissu qui, normalement, ne subit pas EMT. Ceci est avantageux pour l'analyse des premières étapes de l'EMT. Les premières étapes dans EMT ne peuvent pas être étudiés de manière adéquate dans les cellules tumorales qui ont a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'étude a été soutenue par la Fondation Université de Bâle des sciences et de la Fondation nationale suisse par une subvention à MHS et AG (SNF IZLIZ3_157230). Nous remercions: Dr Tania Rinaldi Burkat pour fournir généreusement l'infrastructure; tous les membres du groupe Bettler pour des discussions et des commentaires. Nous remercions Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suisse) pour une installation professionnelle et compétente de la caméra vidéo HD complet MC170 (Leica Microsystems, Suisse).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
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