Модель энзимов и бессывороточной Neural стволовых клеток культуры для ЕМТ Исследование Пригоден для обнаружения лекарственных средств
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Эпителиальные к переходу мезенхимальных (EMT) описывает процесс эпителий transdifferentiating в мезенхимы. EMT является фундаментальным процессом во время эмбрионального развития, что также обычно происходит в глиобластомы, наиболее частой злокачественной опухоли головного мозга. ЕМТ также наблюдалась в нескольких карциномах вне мозга, включая рак молочной железы, рак легкого, рак толстой кишки, рак желудка. ЕМТ централизованно связан с злокачественности путем содействия миграции, вторжения и образование метастаз. Механизмы индукции EMT до конца не изучены. Здесь мы опишем систему в пробирке для стандартизированной изоляции корковых нервных стволовых клеток (NSC , ) и последующим EMT-индукции. Эта система обеспечивает гибкость в использовании либо отдельных клеток или эксплант. В этой системе, крысы или мыши эмбриональные переднего мозга NSC, культивируют в определенной среде, лишенной сыворотки и ферментов. В NSCs выражается OLIG2 и Sox10, два транскрипционных факторов наблюдается в oligodendrocклетки-предшественники YTE (OPCs). С помощью этой системы, взаимодействие между FGF – , BMP- и TGF – beta-сигнализации с участием Zeb1, Zeb2 и Twist2 наблюдались где TGF – beta-активация значительно улучшена миграцию клеток, что указывает на синергический BMP- / TGF – beta-взаимодействия. Результаты указывают на сеть, FGF-BMP- и TGF-beta-сигнализации, которые будут вовлечены в ЕМТ индукции и поддержания. Эта модель система актуальна для исследования EMT в пробирке. Он является экономически эффективным и показывает высокую воспроизводимость. Она также позволяет для сравнения различных соединений в отношении их миграции ответов (количественное измерение расстояния) и высокопроизводительного скрининга соединений ингибировать или усиливать EMT (качественное измерение). Модель поэтому хорошо подходит для тестирования библиотек лекарственных веществ, влияющих на EMT.
Introduction
В течение нескольких стадиях эмбрионального развития, эпителиальные клетки теряют свою твердую приверженность друг к другу (например, плотные соединения) и приобретают миграционный фенотип в процессе , называемом эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT) 1. ЕМТ требуется для формирования дополнительных типов клеток, таких как мезенхимальные клетки нервного гребня, популяции , которая отделяет от нейроэпителии 2. ЕМТ не является существенным только в течение эмбриональной стадии , но также требуется на более поздних этапах взрослой жизни для поддержания физиологических процессов во взрослом организме, таких как заживление ран 3 и центральной нервной системы (ЦНС) регенерации в демиелинизирующих поражений 4.
Эпителиальные опухоли , как известно , для повторной активации EMT в качестве стадии инициирования по миграции, инвазии и метастазирования, в конечном счете , ведет к прогрессированию рака 1,3. ЕМТ действительно централизованно связан с сильной миграции 1,3. Клеточные шаги Conditioning, инициируя, претерпевая и поддержание EMT до конца не изучены и нуждаются в дальнейшем исследовании.
Здесь стандартизированная система в пробирке EMT модель , основанная на NSCs, с определенными факторами роста и средств массовой информации (без сыворотки и без использования фермента) представлен. Эта модель система имеет значение для ученых, работающих над ЕМТ. Белок семейства Snail, Зеб и Twist было показано , что иметь решающее значение для ЕМТ как в развитии и болезни 1. Улитка, Зеб и Twist семьи также участвуют в представленной системе. Система основана на конкретной области переднего мозга, которые, как правило, не претерпевают ЕМТ обеспечивает особое преимущество для изучения исходных событий во время EMT индукции.
Система модель потенциально может быть применена для изучения EMT в эпителии за пределами центральной нервной системы, так как ключевые EMT индукторы, такие как улитка, Зебом и скрутить белки, также найдены во время EMT в системах тканевых за пределами центральной нервной системы. Эта модель system позволяет стандартизированный изоляцию NSCs от развивающейся коры, чтобы изучить особенности стволовых клеток в целом и, в частности, EMT. С помощью этой системы, мы выделили NSCs, индуцированный ЕМТ и изучали последующую миграцию под действием FGF2 и BMP4. Мы наблюдали, что FGF-и взаимодействует BMP сигнализации с TGF-beta-сигнализации для содействия миграции клеток, что подтверждает модельной системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании стандартизированная система EMT анализа с использованием NSCs описана (суммированы в дополнительном рисунке 3). Стандартизация обеспечивает воспроизводимость (таблица 1 и 2). Эти NSC, происходят из развивающейся коры, ткани, которые обычно не претерпева…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование проводилось при поддержке Университета научного фонда Basel и Швейцарского Национального научного фонда за счет гранта в MHS и АГ (SNF IZLIZ3_157230). Мы благодарим: д-р Tania Ринальди Буркат за щедрое предоставление инфраструктуры; все члены группы Bettler для обсуждения и замечания. Мы благодарим Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Швейцария) для профессионального и грамотного монтажа Full HD видеокамеры MC170 (Leica Microsystems, Швейцария).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
References
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
- Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
- Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
- Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. . Atlas of the developing rat nervous system. , (1994).
- O’Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
- O’Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
- Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
- Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
- Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
- Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
- Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
- Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
- Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
- Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
- Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
- Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
- Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
- Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
- Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
- Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
- Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
- McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
- Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
- Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
- Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
- Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
- Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment – migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).
